Cx 4: Кроссовер Mazda CX-4 обновлен в стиле старших моделей — Авторевю

Ваше сообщение отправлено.

Ой, что-то пошло не так…

С кроссовером Mazda CX-4 японцы шагнули в новую для себя нишу — ДРАЙВ

В Пекине состоялась официальная презентация купеобразного, как сами производители называют подобные модели, кроссовера Mazda CX-4. Никаких откровений от него мы, по правде сказать, не ждали, ведь внешность автомобиля была практически полностью рассекречена до премьеры. Компания раскрыла технические подробности и предоставила полную галерею снимков.

Объём багажника — 400 л, при сложенном заднем диване — 1228 л.

С ближайшим родственником, кроссовером CX-5, паркетник CX-4 роднит единая колёсная база — 2700 мм. Правда, новичок чуть длиннее — 4633 мм (+78 мм), но при этом ниже — 1535 мм (паркетник CX-5 выше на 135 мм). В ширину обе машины идентичны. Дорожный просвет в зависимости от модификации варьируется от 191 до 197 мм.

Салон СX-4 отличается от интерьера родственного CX-5. Тут совершенно другая передняя панель и новая мультимедийная установка.

В Китае автомобиль будет предлагаться с двумя моторами на выбор: атмосферной двухлитровой бензиновой «четвёркой» мощностью 158 л.с. и 192-сильным двигателем. Оба мотора агрегатируются с шестиступенчатым «автоматом». Машина с более слабым агрегатом доступна только с передним приводом, а полноприводным может быть кроссовер CX-4 с двигателем 2.5. Кроме того, стало известно, что паркетник получил систему рекуперации кинетической энергии i-ELOOP. Кроссовер будет продаваться пока только на китайском рынке.

Новый Mazda CX-4 2016-2017 фото видео цена Мазда СХ-4 характеристики

В рамках пекинского автосалона состоялась официальная презентация абсолютно нового кроссовера с кузовом купе Mazda CX-4.

новый кроссовер купе Мазда СХ-4 2016-2017 года

Автомобиль стал наследником концептуальной модели Mazda Koeru, которую представили широкой публике в прошлом году на автошоу, прошедшем в Германии (Frankfurt Motor Show). Так как серийная модель всегда отличается от концепта, то тут надо сказать дизайнеры постарались максимально сохранить внешний вид прототипа, правда все равно немного досталось оптике.
Отметим, что по сравнению с провальным Ниссан Кикс, новая Мазда максимально соответствует своему прообразу.

Внешний вид Мазда СХ-4 2016-2017

Как уже говорилось выше, внешний облик как у концепта, не так все шикарно конечно, но взгляду есть за что зацепиться. Фронтальная часть довольно крупная, в качестве головной светотехники используются светодиодные фары в виде капель. Перед украшен решеткой радиатора в фирменном стиле компании, с неизменным значком в виде крыльев.

Mazda CX4, вид спереди

Передний бампер массивный, с большой открытой частью для забора воздуха и небольшими отверстиями по бокам для противотуманок. В чем то передняя часть сильно смахивает на младшего брата CX-3.
Боковая часть выполнена в спортивном стиле, тут и большие арки колес с раздутыми формами. Колеса стоят тоже немаленькие, на 19 дюймов.

Мазда СХ-4, вид сзади

Задняя часть, как и полагается кузову купе, плавно исходит из крыши, оснащена большой задней дверью и большим углом наклона заднего стекла. Задние фонари также отличаются своим неповторимым стилем, выполненные на светодиодах с применением 3D графики, Бампер сзади под стать переднему, крупный и имеющий в наличии серьезную пластиковую накладку для защиты от небольших повреждений.

Салон нового кроссовера Mazda CX-4

А вот что касается интерьера, то тут изменения минимальны, чуть видоизмененная передняя панель и центральная консоль, немного изменили расположение органов управления, в остальном те кто бывал в салоне CX-3 и CX-5 не найдут особых изменений.

панель приборов Mazda CX4

Помимо уже известного можно выделить возможность подбора цветовой гаммы салона на свой вкус, это может быть черный, бежевый, белый и красный салон. Стандартная комплектация может похвастаться системой мультимедии с дисплеем на 7 дюймов, в которую входят все востребованные функции (навигатор, камеры обзора, вай-фай, юсб и др.).

Имеется в наличии климат-контроль спереди и сзади и комплексная система безопасности (круиз-контроль, система распознавания разметки и знаков, автоматическое торможение перед препятствием или пешеходом, регулировка света фар, контролирования слепых зон зеркал заднего вида и др.).

Габаритные размеры Мазда СХ4

По своим размерам новый кроссовер занял золотую середину:

• его длина составит 4 м и 60 см,
• ширина 1 м и 84 см,
• высота совсем небольшая всего 1,5 метра,
• колесная база 2 м и 70 см,
• а клиренс до 210 мм, в зависимости от типа привода.

Технические характеристики Mazda CX-4 2016-2017

Очень примечательно, что сх-4 сконструирован на базе сх-5, а это значит пространства в нем предостаточно. Изменились только настройки подвески (независимая, спереди на стойках Макферсон, сзади многорычажная), призванные обеспечить устойчивость. По сути 4-я версия это тот же 5-й, но со спортивным характером.
В подкапотном пространстве расположатся 2 двигателя:
Бензиновый SkyActive-G 2.0 с максимальной мощностью 156 лошадей и пиком крутящего момента 202 Нм, работает в паре с 6-ступенчатой автоматической коробкой. Устанавливается на переднеприводную версию, расход на сотню составит около 6,5 литров в смешанном режиме;
Устанавливаемый на полноприводную версию SkyActive-G 2.5, максимальная мощность 192 л.с, а крутящий момент достигает 253 Нм. Работает также в паре с 6-ступенчатым автоматом и расходует в смешанном режиме 7,2 литра на сотню.

Цена мазда сх4 2016-2017

Уже известно, что новинка появится и на европейском и на российском рынке, вот только дата пока не уточняется. Зато в Китае уже этим летом начинается серийное производство, в продажу поступят первые Mazda CX-4 по цене от 20 до 30 тыс. долларов, в зависимости от комплектации.

Видео Mazda CX-4 2016-2017 года:

Новая Мазда СХ-4 2016-2017 фото:

Другие записи по теме:

скоро появится — новый внедорожник для Женевского автосалона

ОБНОВЛЕНИЕ 05.02.19: Представитель Mazda Дрю Кэри подтвердил, что эта новая модель, показываемая в Женеве, поступит в США, хотя он не сказал окончательно, как она будет называться. Автомобиль европейской спецификации будет показан в Женеве, а это означает, что автомобиль, который в конечном итоге достигнет наших берегов, может немного отличаться с точки зрения внешнего дизайна и предложений трансмиссии.

В течение нескольких лет Mazda продает в Китае кроссовер под названием CX-4, который по сути является более модной, похожей на купе версией CX-5. Теперь Mazda выпустила тизер новой модели кроссовера, которая дебютирует на автосалоне в Женеве в следующем месяце, и мы думаем, что это следующее поколение CX-4.

На изображении-тизере, которое мы здесь осветлили, показана задняя часть низкорасположенного компактного внедорожника с широкой стойкой и круглыми светодиодными фонарями в задних фонарях. Хотя по этому изображению сложно судить о размере, ожидайте, что CX-4 будет значительно больше, чем субкомпактный CX-3. Mazda заявляет, что новая модель основана на той же архитектуре Skyactiv нового поколения, что и последняя Mazda 3, что говорит нам о том, что CX-4 имеет большие шансы попасть в Соединенные Штаты (версия только для Китая, изображенная ниже, был основан на основе старого, первого поколения CX-5).

Mazda

Этот новый стиль кузова, который, по-видимому, будет иметь более стильную линию крыши, точно соответствует стремлению Mazda стать брендом премиум-класса. Почти все европейские производители роскошных автомобилей теперь выпускают модели внедорожников, похожие на купели, такие как BMW X4 и Mercedes-Benz GLC Coupe, поэтому для Mazda вполне естественно подражать этим творениям. И что бы это ни стоило, мы поместили уходящий CX-4 в наш список из 14 автомобилей, которые автопроизводителям глупо не продавать в США.С. в прошлом году.

CX-4 вряд ли будет единственной новой моделью кроссовера, которую Mazda добавит в свою линейку внедорожников в США в ближайшем будущем. Мы также слышим, что компания работает над новым среднеразмерным внедорожником, возможно, возрождением старого шильдика CX-7, который будет построен на новом заводе в Алабаме, совместно с Toyota.

Следите за новостями, чтобы узнать больше о новой Mazda CX-4, которая официально дебютирует на Женевском автосалоне в марте.

Этот контент создается и поддерживается третьей стороной и импортируется на эту страницу, чтобы помочь пользователям указать свои адреса электронной почты.Вы можете найти дополнительную информацию об этом и подобном контенте на сайте piano.io.

Mazda CX-30 названа, потому что CX-4 уже существует [ОБНОВЛЕНИЕ]

ОБНОВЛЕНИЕ: Представитель Mazda Дрю Кэри дал дальнейшее объяснение названия CX-30, отметив стиль модели.

«Но в то время как CX-30 прекрасно подходит между CX-3 и CX-5 по большинству размеров, Mazda дала ему отличительное имя, потому что это совершенно новый автомобиль с функциями, которые еще не доступны в других моделях линейки. и первая из моделей CX до адаптирует к новому дизайну Kodo.«

« Будут ли будущие модели CX следовать этой философии именования в своих показах, нам придется подождать и посмотреть ».

Если вы думаете, что Mazda CX-30 название странное, вы не одиноки. В нынешнюю эпоху все кроссоверы бренда используют трехзначное прозвище, включая CX-3, CX-5, CX-9 и даже несуществующий CX-7. Зачем менять вещи сейчас? Причина становится еще более запутанной.

26 Фото

По размеру 173-дюймовый CX-30 находится прямо посередине 179-го.1-дюймовый CX-5 и 168,3-дюймовый CX-3. Таким образом, название CX-4 кажется естественным, подходящим для новой модели. Однако Mazda не видит этого, потому что уже есть кроссовер CX-4, который доступен исключительно в Китае. В ходе обсуждения с Car и Driver представитель Mazda решил избежать потенциальной путаницы, связанной с наличием двух совершенно разных моделей с одинаковым названием в разных регионах. Поэтому автопроизводитель решил создать новое прозвище.

С корпоративной точки зрения это решение в некоторой степени понятно, поскольку коллеги могут запутать обсуждаемую модель, если один из них упомянет CX-4.Имеется в виду тот человек, который находится в Китае, или тот, кто повсюду?

Однако другие автопроизводители разбираются в этой проблеме. Текущий Volkswagen Passat, доступный в Соединенных Штатах, использует платформу, совершенно отличную от платформы, доступной в Европе. С таким же успехом они могли быть двумя отдельными транспортными средствами, не считая названия. Даже в прошлом Honda создавала одну версию Civic и Accord для Европы и отдельные для Америки.

Этот аргумент не работает и с точки зрения потребителя.Текущий CX-4 является эксклюзивным для Китая, поэтому практически нет шансов, что кто-то в США или Европе увидит его в дороге, захочет его купить, а затем запутается, почему у другой модели такое же имя.

Как писал Шекспир: «Роза под любым другим названием будет пахнуть так же сладко», и, независимо от названия, CX-30 выглядит на бумаге как неотразимая запись в мире стильных компактных кроссоверов. Кроссовер может прибыть в США до конца года.

Источник: Car and Driver

Новый крутой кроссовер Mazda CX-4, к сожалению, только для Китая

ХИРОШИМА, Япония — Mazda Motor Corporation представила новый кроссовер Mazda CX-4 на автосалоне в Пекине (Auto China 2016).* 1 Последняя версия линейки Mazda нового поколения использует SKYACTIV TECHNOLOGY и дизайн KODO — Soul of Motion и поступит в продажу в Китае в июне.

CX-4 был создан, чтобы превзойти существующие категории и стереотипы. Динамичный дизайн безошибочно соответствует форме KODO, ровная посадка и гладкая кабина в стиле купе придают модели непревзойденный вид. Клиенты оценят исключительную функциональность и удобство использования, в том числе простоту входа и выхода из автомобиля, а также гибкое грузовое пространство.Благодаря дорожному просвету, подобному внедорожнику, и системе полного привода Mazda i-ACTIV AWD * 2, CX-4 готов к работе в широком диапазоне дорожных условий и предлагает сочетание выдающихся экологических характеристик и безопасности (Sustainable Zoom-Zoom ) и чувство вождения Jinba-ittai с отличной управляемостью благодаря низкому центру тяжести.

«CX-4 — наша четвертая модель нового поколения в Китае, — сказал Нобухиде Инамото, старший управляющий директор, курирующий операции в Китае. «Спрос на внедорожники здесь чрезвычайно высок, и мы ожидаем, что эта модель сыграет большую роль в расширении бренда Mazda на этом рынке.Мы продолжим работать над укреплением нашего бренда в Китае, стремясь стать брендом, который обогащает жизнь людей с помощью автомобилей ».

Mazda CX-4 Основные характеристики

Общая длина	мм	4 633
Общая ширина	мм	1,840
Общая высота	мм	1 535	1 530	1 535
Колесная база	мм	2,700
Дорожный просвет	мм	197	196	194 * 3
Привод		передняя передача		i-ACTIV-AWD
Двигатель		SKYACTIV-G 2. 0 (2,0-литровый бензин)		SKYACTIV-G 2,5 (2,5-литровый бензин)
Трансмиссия		SKYACTIV-MT (6-МКПП)	SKYACTIV-DRIVE (6-ступенчатая АКПП)
Расход топлива (смешанный) * 4	литров / 100 км	6,4	6,3	7,2 * 5
Тип подвески (перед / зад)		Стойка Макферсон / многорычажная
Рулевое управление		Рейка и шестерня
Тип тормоза (передний / задний)		Дисковые вентилируемые / цельные
Шины		225 / 65R17		225 / 55R19
Оборудование		i-ACTIVSENSE передовые технологии безопасности, автомобильная система подключения MZD Connect * 6 , функция автоматического удержания и т. Д.

CX-5461 активирует ответ на повреждение ДНК и демонстрирует терапевтическую эффективность при серозном раке яичников высокой степени злокачественности

Активность CX-5461 в клеточных линиях OVCA

Оценивали действие CX-5461 in vitro на клетки OVCA человека. с использованием панели из 32 установленных линий клеток OVCA человека. Эти клеточные линии были выбраны так, чтобы они представляли ряд гистологических подтипов OVCA (дополнительная таблица 1). Возрастающие концентрации (1 нМ – 10 мкМ) CX-5461 использовали для оценки концентрации лекарственного средства, которое индуцировало 50% снижение пролиферации клеток (GI ₅₀ ) через 48 часов (ч).Значения GI ₅₀ варьировались между отдельными клеточными линиями и составляли от 12 нМ для OVCAR3 до 5,17 мкМ для OV90 (рис. 1а). Клеточные линии были определены как чувствительные к CX-5461, если GI ₅₀ был ниже геометрической медианы 363 нМ. Статистически значимой корреляции между статусом мутации TP53 и чувствительностью к CX-5461 не было (дополнительная таблица 1, рис. 1b). Эффективность подавления роста с помощью CX-5461 коррелировала с более высокой скоростью базальной транскрипции рДНК в чувствительных по сравнению с устойчивыми клеточными линиями OVCA (рис.1в). Однако как чувствительные, так и устойчивые к CX-5461 линии клеток показали одинаковые уровни ингибирования транскрипции Pol I после 1 ч обработки CX-5461 с концентрациями, которые ингибируют транскрипцию Pol I на 50% (IC ₅₀ ), в диапазоне от 38 до 285. нМ (рис. 1г и д). Данные показывают, что CX-5461 нацелен на ингибирование транскрипции Pol I в дозах, в 10 раз меньших, чем диапазон концентраций в плазме (584,1–3,3 мкМ), использованный в фазе I исследования повышения дозы CX-5461 ¹⁶ .

a Дозы CX-5461, которые вызывают 50% ингибирование роста (GI ₅₀ ) через 48 часов. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Звездочки обозначают статус мутировавшего TP53 . Среднее геометрическое значение GI ₅₀ дозы 363 нМ показано тонкой линией. Информация о каждом источнике клеточных линий, средние значения G1 ₅₀ , SD и значения N приведены в дополнительной таблице 1.Выделенные 12 CX-5461-чувствительных и 11 CX-5461-устойчивых клеточных линий были использованы для идентификации сигнатур экспрессии генов, чувствительных к CX-5461, на фиг. 2a. b CX-5461 GI ₅₀ доз TP53 дикого типа и TP53 мутантных линий клеток OVCA, как указано в ( a ). Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Манна – Уитни. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. c Исходные скорости транскрипции рДНК клеточных линий OVCA (перечислены в ( d )), как определено количественным анализом ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с использованием праймеров, специфичных для внешнего транскрибируемого спейсера 5’ETS (+ 413– 521 п. н.) относительно сайта начала транскрипции (TSS).Уровни экспрессии в каждой клеточной линии были нормализованы к мРНК виментина и выражены как кратное изменение относительно клеток TOV112D. Каждая точка представляет собой среднее значение n = 3 биологически независимых эксперимента на клеточную линию (отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4). Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего непарного теста t . d Кривые доза-ответ для уровней рРНК-предшественника 47S, измеренные с помощью количественной ОТ-ПЦР.Клеточные линии OVCA обрабатывали носителем или увеличивающимися концентрациями лекарственного средства CX-5461 (0,001, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1 и 3 мкМ) в течение 1 часа перед сбором РНК. Уровни экспрессии нормализовали по мРНК виментина и выражали как кратное изменение по сравнению с контролями, обработанными носителем. Показано среднее значение n = 3 независимых биологических эксперимента для каждой клеточной линии. (Отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4). e Представлены средние значения ингибирующей концентрации, которые привели к 50% ингибированию транскрипции (IC ₅₀ ) (из n = 3 биологически независимых эксперимента для каждой клеточной линии) из D (отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4 ).Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Манна – Уитни.

CX-5461 демонстрирует синтетическую летальность с HRD в HGSOC

Чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе чувствительности CX-5461 в OVCA, были созданы профили экспрессии генов для 12 CX-5461-чувствительных и 11-устойчивых линий клеток (рис. 1a) . Анализ обогащения набора генов (GSEA) выявил мутацию BRCA1, а MYC нацелена на сигнатуры экспрессии генов, чтобы коррелировать с чувствительностью к CX-5461 in vitro (рис.2а, дополнительный рис. 1). Действительно, мы наблюдали значительное обогащение сигнатуры экспрессии гена HRD ²⁴ в CX-5461-чувствительных клеточных линиях (рис. 2b). Однако корреляция чувствительности CX-5461 и PARPi в клеточных линиях HGSOC не была очевидной (дополнительный рис. 2), что указывает на то, что дополнительные механизмы HRD придают чувствительность CX-5461. Уровень мутации BRCA1 (BRCAm-sig) и сигнатуры экспрессии онкогенного гена MYC (MYC_UP-sig) точно отличал CX-5461-чувствительные и устойчивые клеточные линии в независимом наборе данных из Энциклопедии линий раковых клеток Института Броуда (CCLE). (Инжир.2в). Мы обнаружили, что использование сигнатур экспрессии генов BRCAm-sig и MYC_UP-sig обеспечивает большую мощность для прогнозирования чувствительности к CX-5461, чем использование BRCAm-sig в ​​качестве единственного предиктора (ANOVA Chi-squared test p -value = 0,026557). В самом деле, чувствительность к CX-5461 также была связана с высокими базальными скоростями транскрипции Pol I (Рис. 1c). Поскольку известно, что высокая активность MYC управляет транскрипцией Pol I на нескольких уровнях ²⁵ , данные согласуются с повышенной активностью MYC, управляющей чувствительностью к CX-5461.Взятые вместе, наши данные предполагают, что CX-5461 может обеспечивать терапевтический эффект при подтипе HGSOC с высоким содержанием MYCN, который классифицируется как повышенная функциональная активность MYC и плохая выживаемость без прогрессирования заболевания ^26,27 .

a GSEA данных экспрессии на микрочипах 12 CX-5461-чувствительных и 11 CX-5461-устойчивых линий клеток (рис. 1a). Показаны графики обогащения наборов генов, идентифицированных как обогащенные в линиях клеток, чувствительных к CX-5461. b GSEA с одним образцом (ssGSEA) использовали для получения уровня активности сигнатуры экспрессии гена HRD ²⁴ в отдельных образцах. Гены в каждом образце были ранжированы в соответствии с их уровнями экспрессии, и оценка для каждого пути была создана на основе эмпирической кумулятивной функции распределения, отражающей, насколько высоко или низко гены были обнаружены в ранжированном списке. n = 32 клеточные линии на фиг. 1a, прямоугольная диаграмма — медиана, верхняя и нижняя петли соответствуют первому и третьему квартилям (25-й и 75-й процентили).Верхние усы простираются до самого большого значения, не превышающего 1,5 * IQR (IQR = межквартильный диапазон). Нижний ус достигает наименьшего значения 1,5 * IQR. Данные за пределами усов нанесены отдельными точками. Статистическая значимость была получена с использованием двусторонних критериев Вилкоксона. c Уровень экспрессии генов-мишеней MYC (MYC_UP-sig) и сигнатуры мутантного гена BRCA1 (BRCAm-sig) рассчитывали в данных по экспрессии РНК от Broad Institute CCLE с использованием ssGSEA. Сигнатуры экспрессии генов MYC_UP-sig и BRCAm-sig более высоко экспрессируются в группе, чувствительной к CX-5461, по сравнению с группой устойчивости (односторонние тесты Вилкоксона p -значение 0. 004762 и 0,009524 соответственно). d Комбинация CX-5461 и миРНК, нацеленная на гены HR в клетках OVCAR4, синергетически подавляет пролиферацию. Четыре индивидуальных дуплекса миРНК на каждый ген подвергали обратной трансфекции в течение 24 часов с последующей обработкой CX-5461 (80 нМ) или носителем в течение 48 часов. Количество клеток измеряли с помощью окрашивания DAPI и отображали с помощью Cellomics. n = 4, каждая точка данных представляет отдельные дуплексы миРНК. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего).Статистический анализ выполняли с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), теста множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). Сопровождающий график (справа) представляет собой график счастья, где каждая точка представляет отдельный дуплекс миРНК. Комбинированный индекс CI <1 указывает на синергию, CI> 1 указывает на антагонизм, а CI = 1 указывает на аддитивный эффект.

Чтобы подтвердить синтетическое летальное взаимодействие CX-5461 с HRD, мы протестировали эффекты коротких интерферирующих РНК (siRNAs), нацеленных на гены HR, на эффективность CX-5461 и продемонстрировали сильное синергетическое ингибирование в клетках HGSOC OVCAR4, которые, как сообщается, очень похожи на геномные. профиль опухолей HGSOC ²⁸ (рис.2г). Кроме того, мы протестировали эффекты ингибирования роста CX-5461 в изогенно подобранных HR-опытных клетках OVCAR8 и производной HR-дефицитной линии клеток с нокаутом RAD51C (KO) OVCAR8, ранее охарактеризованной как отсутствие способности образовывать фокусы RAD51 в ответ на ионизирующее излучение ( IR) ²⁹ (Дополнительный рис. 3a – c. Клеточная линия с дефицитом HR проявляет повышенную чувствительность к ингибированию роста CX-5461 при низких дозах 10 и 100 нМ по сравнению с клетками OVCAR8 (рис. 3a). -профессиональные клетки OVCAR8, CX-5461-опосредованное ингибирование пролиферации было связано с выраженной остановкой клеточного цикла G2 / M, измеренной с помощью окрашивания BrdU / PI (рис. 3b и дополнительный рисунок 3D) и с использованием репортерной системы FUCCI (рисунок 3c и дополнительный рисунок 3E). Клетки OVCAR8, обработанные CX-5461, также демонстрировали нарушение цитокинеза и многоядерность (содержание 8 N ДНК) (рис. 3d и дополнительный рис. 3D), что позволяет предположить, что CX-5461 вызывает дефекты хромосомной сегрегации, возможно, из-за стойкого стресса репликации ДНК и повреждения ДНК в митоз ³⁰ . Для сравнения, HR-дефицитные клетки RAD51C KO OVCAR8 претерпевают гибель клеток при 100 нМ и 1 мкМ CX-5461, что дополнительно подтверждает синтетическое летальное взаимодействие CX-5461 / HRD (рис.3d и дополнительный рис. 3D).

a Динамика пролиферации доза-ответ In vitro CX-5461, оцениваемая по слиянию клеток с использованием IncuCyte ZOOM клеточных линий OVCAR8 и OVCAR8 RAD51C KO. Представитель двух биологически независимых экспериментов. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 5 технических повторений. b Анализ клеточного цикла клеток, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 48 часов и 72 часов и меченных BrdU в течение 30 минут перед сбором.Был проведен аналитический FACS-анализ включения BrdU в зависимости от содержания ДНК (репрезентативные графики и стратегия стробирования показаны на дополнительном рис. 3D). Графики гистограммы, отображающие процент популяций G0 / G1 (синий) и G2M (зеленый) и S-фазы BrdU-меченых (красный) популяций клеток. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 3 биологически независимых эксперимента. c Количественное определение профилей клеточного цикла с использованием FUCCI-меченных клеток, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 48 и 72 часов.Типичные профили проточной цитометрии и стратегия стробирования показаны на дополнительном рис. 3E. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 3 биологически независимых эксперимента. d Гистограммы, отображающие процент клеток с содержанием ДНК> 4n (верхняя панель) и популяции клеток Sub G0 / G1 (нижняя панель), обнаруженные с помощью анализа клеточного цикла BrdU / PI, описанного в ( b ) и дополнительном рис. 3D, ( n, = 3 биологически независимых эксперимента, n = 7 для клеток OVCAR8 и OVCA8 RAD51C KO, обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 72 часов), полосы ошибок представляют собой среднее значение ± SEM.Статистический анализ в B-D выполняли с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). e Вестерн-блоттинг клеток, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 6 и 24 часов. Представитель n = 3 биологически независимых эксперимента. Показанные блоты представляют собой образцы, полученные в одном эксперименте и обработанные параллельно. Контроли загрузки. Винкулин и актин обрабатывали повторным зондированием блотов.Полноразмерное сканирование вестерн-блоттинга представлено на дополнительном рис. 10.

Затем мы исследовали опосредованную CX-5461 активацию передачи сигналов ATM / ATR в клеточных линиях HGSOC (рис. 3e). В соответствии с нашими предыдущими выводами ¹⁹ , CX-5461 индуцировал передачу сигналов ATM / ATR, на что указывает повышенное фосфорилирование ATR T1989, ATM S1981, CHK1 S345, CHK2 T68 и низкая индукция уровней γh3AX в обеих клеточных линиях. Более сильное увеличение фосфорилирования S4 / S8 RPA32 (репликационный белок A), который защищает одноцепочечную ДНК (оцДНК), наблюдалось в HR-дефицитных клетках после 100 нМ и 1 мкМ CX-5461 по сравнению с клетками OVCAR8 с высоким уровнем HR, что указывает на стойкую остановку. вилки репликации ³¹ .Таким образом, CX-5461 вызывает стресс репликации в HR-опытных клетках, связанный с повышенным процентом многоядерных клеток, в то время как HR-дефицитные клетки подвергаются клеточной гибели после обработки CX-5461 из-за обострения репликационного стресса. В целом, эти результаты демонстрируют, что CX-5461 проявляет сильные антипролиферативные эффекты в клетках OVCA и что дефекты HR повышают чувствительность HGSOC-клеток к CX-5461-опосредованной гибели клеток, что согласуется с сигнатурами экспрессии гена BRCA1-мутант и HRD, предсказывающих чувствительность клеток OVCA к CX- 5461 (рис.2а, б).

CX-5461 индуцирует стресс репликации и DDR

Чтобы изучить механизм активации передачи сигналов ATM / ATR, мы исследовали влияние обработки CX-5461 на формирование структур GQ в клетках OVCAR8, OVCAR8 RAD51C KO и OVCAR4 (рис. 4a, b и дополнительный рис. 4A – D). CX-5461 не индуцировал стабилизацию GQ ни в HR-опытных клетках OVCAR8 или OVCAR4, ни в HR-дефицитных клетках OVCAR8 RAD51C KO по сравнению с истинным стабилизатором GQ (TMPyP4) через 1, 3 и 24 часа после обработки.Интересно, что окрашивание GQ было значительно снижено в клетках OVCAR8, обработанных CX-5461 в течение 3 часов. Кроме того, в отличие от обработки CX-5461, TMPyP4 не активировал DDR через 1 час после обработки, когда наблюдалось значительное увеличение стабилизации GQ (дополнительный рисунок 4C-E). Наши данные ясно демонстрируют, что активация DDR, опосредованная CX-5461, не связана со стабилизацией GQ. Это открытие противоречит предыдущему отчету о клетках рака толстой кишки ¹⁷ , предполагающему, что опосредованный CX-5461 эффект на стабилизацию GQ может зависеть от типа клеток.

a Коиммунофлуоресценция (Co-IF) ДНК GQ и UBF в качестве ядрышкового маркера в клетках OVCAR8 и клетках OVCAR8 RAD51C KO, обработанных либо носителем, 1 мкМ CX-5461 или 10 мкМ TMPyP4 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение иммунофлуоресценции ДНК GQ. Интенсивность сигналов анализировали с помощью CellProfiler. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, n = 200 клеток на условия обработки, исследованные в трех независимых экспериментах. c Co-IF анализ R-петель и UBF в клетках, обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения двух биологически независимых экспериментов. d Количественное определение интенсивности сигнала R-петель выполняли с помощью CellProfiler. n = 230 клеток на условие обработки были исследованы в двух независимых экспериментах. Интегрированная интенсивность была нормализована к соответствующему среднему значению контроля носителя OVCAR8. Статистический анализ в ( b ) и ( d ) был выполнен с использованием одностороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Краскела-Уоллиса (показаны скорректированные значения p ).(нс) обозначает незначимое значение p больше 0,05. и Клетки обрабатывали носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. РНК экстрагировали, и уровни предшественников 47S рРНК определяли с использованием праймеров, специфичных для 5’ETS пре-рРНК. Уровни экспрессии были нормализованы к мРНК NONO и выражены как кратное изменение относительно носителя ( n = 3 биологически независимых эксперимента), полосы ошибок представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего, статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа ANOVA, множественного анализа Тьюки. сравнительный тест (показаны скорректированные значения p ).

Затем мы исследовали образование гибридов РНК: ДНК (R-петли), которые являются побочными продуктами транскрипции Pol I. Известно, что стабилизация этих трехцепочечных структур нуклеиновых кислот, состоящих из гибрида ДНК-РНК и замещенной оцДНК, препятствует репликации ДНК и активирует DDR ³² . Недавно было продемонстрировано, что стабилизация R-петель совпадает с ингибированием транскрипции Pol I и активацией ядрышкового DDR после умеренного гипоосмотического стресса ³³ . Чтобы маркировать ядрышковые R-петли, мы выполнили co-IF для восходящего связывающего фактора транскрипции (UBF), который локализуется в деконденсированном хроматине рДНК ^34,35 .Наблюдалось резкое изменение окраски ядрышковой R-петли: от слабого и диффузного в контрольных OVCAR8 и OVCAR4 до очагового рисунка с более интенсивными очагами в обработанных CX-5461 клетках (рис. 4c, d и дополнительный рис. 5A – C) . Это предполагает, что CX-5461-индуцированное смещение Pol I с промоторов рДНК ^19,36 связано со стабилизацией R-петель, возможно, из-за ингибирования инициации, совпадающего с ингибированием процессинга предшественников рРНК, что приводит к стабилизации R-петель от транскрипты, уже созданные удлиняющими молекулами Pol I.Интересно, что клетки RAD51C KO OVCAR8 обнаруживают высокий базальный уровень котранскрипционных R-петель (Fig. 4c, d), что совпадает с более высокой базальной скоростью транскрипции рДНК по сравнению с родительскими клетками (Fig. 4e). Таким образом, данные указывают на участие RAD51C и / или активности HR в негативной регуляции транскрипции Pol 1. Однако истощение RAD51C не взаимодействовало с обработкой 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в дальнейшем снижении транскрипции рДНК или в увеличении накопления ядрышковых R-петель по сравнению с обработанными CX-5461 клетками OVCAR8.

Чтобы оценить стресс репликации на рДНК, мы исследовали, индуцирует ли CX-5461 ATR в ядрышках (рис. 5a). Действительно, pATR T1989 был обнаружен после обработки CX-5461 на периферии ядрышковых R-петель, локализуясь вместе с UBF в обработанных CX-5461 HR-опытных клетках OVCAR8 и OVCAR4 (рис. 5a, b, дополнительный рис. 5d– f и дополнительный рис. 6a). Локализация ATR на периферии ядрышек согласуется с хорошо охарактеризованным перемещением поврежденной рДНК к точкам закрепления на периферии ядрышка, где она более доступна для факторов репарации ДНК ³⁷ .Активация ATR в ответ на CX-5461 не ограничивалась ядрышками в клетках S-фазы и индуцировалась в EdU-отрицательных и EdU-положительных HR-дефектных популяциях клеток (фиг. 5a, b). Эти данные предполагают, что ATR активируется в ответ на вызванные CX-5461 дефекты репликации ДНК, которые возникают в S-фазе и в ответ на дополнительные дефекты независимо от клеточного цикла. Чтобы проверить, требуется ли активация DDR в нереплицирующихся клетках для CX-5461-опосредованного ингибирования роста, мы проанализировали влияние обработки CX-5461 на отсортированные G1, S и G2 FUCCI-меченные клетки OVCAR8 и RAD51C KO OVCAR8 (дополнительный рис. .6Б). Независимо от стадии клеточного цикла обработка CX-5461 приводила к остановке клеточного цикла G2. Из-за отсутствия активности p53 в клетках OVCAR8 остановка контрольной точки G2, по-видимому, является основным ответом на CX-5461, что позволяет предположить, что репликация ДНК необходима для эффектов ингибирования роста CX-5461.

a Co-IF анализ pATR (T1989) и UBF в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение интенсивности сигнала колокализованных областей pATR / UBF и общего pATR выполняли с использованием CellProfiler и нормализовали до медианы контрольных значений, обработанных носителем. n, = 464 EdU-положительных клеток и n = 250 EdU-отрицательных клеток на условия лечения, исследованные в трех биологически независимых экспериментах. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Краскела – Уоллиса (показаны скорректированные значения p ). c Co-IF анализ pRPA32 (S33) и UBF в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. d Количественное определение интенсивности сигнала колокализованных областей pRPA / UBF и общего pRPA выполняли с использованием CellProfiler и нормализовали до медианы контрольных групп, обработанных носителем. n, = 216 EdU-положительных и n = 270 EdU-отрицательных клеток на условия лечения, исследованные в трех независимых экспериментах.Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполняли с использованием одностороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Краскела – Уоллиса (показаны скорректированные значения p ).

оцДНК, покрытая RPA, рекрутирует и активирует многочисленные регуляторы репарации ДНК и контрольных точек клеточного цикла, включая ATR. ATR фосфорилирует RPA32 в S33 сразу после остановки вилки ³¹ . Поэтому мы исследовали фосфорилирование S33 RPA32 после обработки CX-5461 и наблюдали значительную локализацию pRPA32 S33 в ядрышках как в HR-опытных, так и в HR-дефицитных клетках (рис.5в – г). CX-5461-опосредованное фосфорилирование S33 RPA не зависело от стадии клеточного цикла и не ограничивалось ядрышками в HR-дефицитных клетках. Таким образом, образование структур оцДНК в клетках, обработанных CX-5461, может приводить к остановке репликационной вилки и активации ATR с HRD, усиливая CX-5461-опосредованный стресс репликации, и это может лежать в основе синтетического летального взаимодействия CX-5461 с HRD.

Затем мы оценили вклад стабилизации R-петель в опосредованную CX-5461 токсичность за счет сверхэкспрессии рибонуклеазы H 1 (РНКазы H), которая специфически деградирует фрагмент РНК в РНК: гибриды ДНК ³⁸ для предотвращения стабилизации R-петли в RAD51C KO OVCAR8 клетки (дополнительный рис. 7А). Сверхэкспрессия РНКазы H снижает уровни ядрышковых R-петель в клетках OVCAR8 RAD51C KO, обработанных CX-5461, по сравнению с контролем-носителем, однако это не предотвращает опосредованное CX-5461 фосфорилирование S33 RPA в течение 3 часов после обработки, что указывает на присутствие оцДНК и вилки. сваливание (дополнительный рис. 7B, C). Через 24 часа после обработки CX-5461 сверхэкспрессия РНКазы H частично снижает глобальный репликационный стресс, отмеченный фосфорилированием RPA32 S4 / S8, однако это не устраняет эффекты ингибирования роста CX-5461 (дополнительный рис.7D, E). В целом, наши данные предполагают участие CX-5461 в индукции структур оцДНК и стресса репликации на рДНК, причем стабилизация R-петель свидетельствует о дефектах хроматина на рДНК и вносит вклад в опосредованную CX-5461 DDR, но не является существенной для эффективности CX-5461.

CX-5461 взаимодействует с PARPi в индукции стресса репликации

Затем мы исследовали образование очагов γh3AX после 3-часовой обработки CX-5461, когда было обнаружено фосфорилирование ATR и RPA. CX-5461 индуцировал глобальные фокусы γh3AX только в EdU-положительной популяции HR-опытных клеток OVCAR8, что позволяет предположить, что вызванное CX-5461 повреждение ДНК связано с репликацией ДНК (рис.6а, б). HR-дефицитные клетки RAD51C KO OVCAR8, обработанные CX-5461, проявляли высокие уровни активации ATR (фиг. 5b) и γh3AX фокусов (фиг. 6a, b) как в EdU-положительной, так и в -отрицательной популяциях. Эти данные предполагают, что стресс репликации — не единственная причина повреждения ДНК, вызванного CX-5461. Однако наши данные с использованием отсортированных клеток G1 с использованием системы FUCCI (дополнительный рис. 6b) продемонстрировали, что DDR, индуцированный CX-5461, не влиял на клетки G1, которые прогрессировали до G2 до остановки, предполагая, что репликация ДНК необходима для ингибитора роста CX-5461. последствия.

a Co-IF анализ γh3AX в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение количества очагов проводили с помощью CellProfiler. n = 250 EdU-положительных клеток и n = 220 EdU-отрицательных клеток на условия лечения были исследованы в трех независимых экспериментах.Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. c Длина дорожки IdU уменьшена в CX-5461 за счет механизма, зависимого от MRE11. Схема использованного метода импульсной маркировки CIdU и IdU (вверху). Клетки OVCAR8 последовательно метили и либо обрабатывали, либо обрабатывали 1 мкМ CX-5461, 50 мМ мирина или их комбинацией в течение 3 часов. Волокна были обработаны для анализа волокон ДНК. Длина репликационной вилки была рассчитана на основе длины отдельных треков IdU, измеренных с помощью программного обеспечения ImageJ. Длины треков IdU (в мкм) были преобразованы в kb (1 kb = 2.59 мкм). n = 150 репликационных треков были проанализированы в двух биологически независимых экспериментах. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. d Анализ волокон ДНК клеток OVCAR8, предварительно обработанных 100 нМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или в комбинации, промытых, а затем последовательно меченных CldU и IdU, как показано на схеме (вверху). Волокна обрабатывали и анализировали, как описано выше. n = 150 репликационных треков были проанализированы в двух независимых экспериментах. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.Статистический анализ (в b — d ) был выполнен с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Краскела – Уоллиса (показаны скорректированные значения p ). NS обозначает незначимое значение p > 0,05.

BRCA1 / 2 и RAD51 играют главную роль в стабилизации репликационной вилки после репликационного стресса, предотвращая нуклеолитическую деградацию репликационных вилок нуклеазой MRE11 ³⁹ . Поэтому мы провели анализ волокон ДНК, чтобы изучить влияние CX-5461 на стабилизацию вилки (рис.6c и дополнительный рис. 8A) в ячейках OVCAR8. Растущие треки репликации последовательно метили CldU и IdU перед обработкой CX-5461 в течение 3 часов. Обработка CX-5461 вызывает общее уменьшение длины трека, предполагая деградацию репликационных вилок при индукции DDR CX-5461. Это было устранено совместной обработкой мирином, ингибитором MRE11, что подтверждает, что ингибирование нуклеазы MRE11 может спасти опосредованную CX-5461 дестабилизацию вилки. Затем мы оценили, влияет ли повреждение ДНК, вызванное обработкой CX-5461, на развитие вилки, путем предварительной обработки клеток CX-5461 в течение 24 часов, а затем импульсной метки обоих аналогов (рис.6г). Предварительная обработка CX-5461 не повлияла на длину вилки, что позволяет предположить, что CX-5461 не вызывает каких-либо повреждений, которые могли бы повлиять на перезапуск вилки или прогрессирование. С другой стороны, PARPi талазопариб (BMN-673) увеличивает прогрессию вилки в согласии с недавним сообщением, что опосредованное PARPi ускорение удлинения вилки является механизмом стресса репликации и повреждения ДНК ⁴⁰ . Таким образом, наши данные демонстрируют, что CX-5461 и PARPi вызывают стресс репликации посредством различных эффектов на дестабилизацию вилки, указывая на независимые синтетические летальные взаимодействия с HRD.Более того, комбинация CX-5461 и BMN-673 приводила к значительному увеличению образования очагов γh3AX в HR-опытных и HR-дефицитных клетках (рис. 7a, b), предполагая их сотрудничество в усилении репликационного стресса и повреждений ДНК. Поскольку путь HR необходим для противодействия стрессу репликации путем стабилизации остановившихся вилок репликации, мы также исследовали активацию пути HR после лечения CX-5461. Мы обнаружили, что CX-5461 индуцировал образование фокусов RAD51, что указывало на загрузку RAD51 на DSB, в то время как комбинация CX-5461 и BMN-673 приводила к дальнейшему усилению образования фокусов RAD51 (рис.7а, б). Таким образом, DDR, опосредованный CX-5461, активирует HR вплоть до стадии загрузки RAD51, а его взаимодействие с BMN-673 при обострении репликационного стресса усиливает активацию пути HR. Кроме того, в соответствии с активацией CX-5461 MRE11-опосредованной деградации вилок, CX-5461 индуцировал pRPA S4 / S8, маркер остановленных репликационных вилок в HR-опытных, но более устойчивых в HR-дефицитных клетках RAD51C KO OVCAR8 (рис. 7C). Кроме того, CX-5461 взаимодействует с BMN-673, индуцируя уровни pRPA S4 / S8 в HR-дефицитных клетках OVCAR8 RAD51C KO.Таким образом, CX-5461, PARPi и HRD взаимодействуют в усилении репликационного стресса. Взятые вместе, наши данные согласуются с моделью (рис. 7D), с помощью которой CX-5461 ингибирует рекрутирование Pol I, приводящее к дефектам хроматина рДНК, включая образование оцДНК и стресс репликации на рДНК. CX-5461 также вызывает глобальный стресс репликации, связанный с остановкой и дестабилизацией репликационных вилок за счет активности MRE11, что приводит к повреждению ДНК. HRD усиливает стресс репликации, опосредованный CX-5461. Комбинация CX-5461 и PARPi еще больше усугубляет репликационный стресс, и это подкрепляет синтетические летальные взаимодействия PARPi / CX-5461 / HRD (рис. 7г).

a Клетки OVCAR8 инкубировали с 10 мкМ EdU перед обработкой носителем, 100 нМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или их комбинацией в течение 24 часов. Был проведен Co-IF для γh3AX и RAD51. Клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с реакцией Click-IT, промывали PBS и затем окрашивали DAPI. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение количества очагов γh3AX. n, = 554 клетки OVCAR8 и n = 708 клеток OVCAR8 RAD51C KO для каждого условия обработки были проанализированы в трех биологически независимых экспериментах. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. Количественное определение количества фокусов RAD51 в EdU-положительных клетках. n, = 223 EdU + ve OVCAR8 и n = 221 OVCAR8 RAD51C KO клеток на условия обработки, проанализированные в трех независимых экспериментах. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.Статистический анализ выполняли с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), теста множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). c Вестерн-блоттинг клеток, обработанных как в ( a ). Представитель n = 2 биологически независимых эксперимента. Показанные блоты представляют собой образцы, полученные в одном эксперименте и обработанные параллельно. Полные размеры сканирования вестерн-блотов представлены на дополнительном рисунке 10. d Схема молекулярного ответа на CX-5461.CX-5461 ингибирует комплекс транскрипции Pol I, связываясь с комплексом селективности 1 (SL-1) и предотвращая связывание Pol I с промоторами гена рРНК. Смещение Pol I и ингибирование инициации транскрипции Pol I связаны со стабилизацией R-петель, привлечением RPA к одноцепочечной рДНК, стрессом репликации рДНК и активацией DDR в ядрышках. CX-5461 также вызывает глобальный стресс репликации, связанный с остановкой и дестабилизацией репликационных вилок за счет активности MRE11, что приводит к повреждению ДНК, S-фазе и остановке клеточного цикла G2 / M. Путь HR и активность PARP необходимы для противодействия стрессу репликации ДНК. CX-5461 взаимодействует с HRD и ингибирует активность PARP, усугубляя репликационный стресс и повреждение ДНК, способствуя гибели клеток.

CX-5461 взаимодействует с PARPi для подавления роста клеток HGSOC

Поскольку CX-5461 в сочетании с BMN-673 приводит к увеличению повреждения ДНК, мы предположили, что сочетание CX-5461 с PARPi или другими ингибиторами репарации ДНК и DDR (терапия DDR ) может повысить эффективность лечения HGSOC.Поэтому мы провели целенаправленный / специализированный скрининг лекарств в HR-квалифицированных клетках OVCAR4 на предмет репарации ДНК и ингибиторов DDR, которые могут взаимодействовать с CX-5461 для усиления задержки роста (рис. 8a). Были продемонстрированы ингибиторы ATM (ATMi: KU55933), ATR (ATRi: VE-821), PARP (BMN-673), химиотерапевтический препарат на основе платины цисплатин, ингибитор mTORC1 эверолимус и селективный ингибитор BCL-2 ABT-199. ингибирующие рост эффекты в виде отдельных агентов. Однако комбинация GI ₂₀ дозы CX-5461 с BMN-673 и VE-821 (ATRi) показала наиболее усиленную задержку пролиферации по сравнению с эффектами одного агента и по сравнению с комбинациями с другими соединениями (рис.8а). Затем мы исследовали взаимодействие между CX-5461 и BMN-673 или ATRi в индукции гибели клеток в трех дополнительных HR-зависимых клеточных линиях HGSOC (дополнительный рис. 3C) и определили устойчивые и значительные взаимодействия между BMN-673 и CX-5461 в индуцировании гибель клеток по сравнению с ATRi (VE-821) (рис. 8b). Кроме того, кривые доза-ответ BMN-673 в присутствии или в отсутствие CX-5461 подтверждают сильное взаимодействие CX-5461 с BMN-673 (фиг. 8c). Кроме того, комбинация CX-5461 и BMN-673 приводила к усилению остановки клеточного цикла G2 / M, усиленному ингибированию пролиферации клеток (рис.8d – e) и значительно снижает клоногенную выживаемость HR-опытных (OVCAR8 и OV90) и HR-дефицитных (OVCAR8 RAD51C KO) клеток. Для сравнения, снижение чувствительности к отдельным агентам и комбинации в иммортализованных эпителиальных клетках фаллопиевых труб человека FT282 демонстрирует четкое терапевтическое окно для этих методов лечения (рис. 8f, g).

a Мини-скрининг лекарств в клетках OVCAR4, обработанных возрастающими дозами цисплатина (0–1.11 мкМ), PARPi (BMN-673, 0–0,11 мкМ), ATMi (KU55933, 0–1,11 мкМ), ATRi (VE-821, 0–1,11 мкМ), ABT-119 (0–1,11 мкМ) или эверолимус ( 0-0,11 мкМ) ± 80 нМ (GI ₂₀ ) CX-5461. Цветовое кодирование обозначает уровень пролиферации, измеренный окрашиванием DAPI и визуализацией с использованием Cellomics (зеленый цвет означает снижение пролиферации). Дозовый ответ при лечении одним лекарственным средством корректировали для контроля носителя, а комбинацию корректировали на ответ на 80 нМ CX-5461, представлены средние значения n = 5.Комбинация CX-5461 с BMN-673 или ATRi выделена желтыми полями. b Количественное определение содержания ДНК SubG1 путем окрашивания PI клеток, обработанных носителем, 100 нМ CX-5461, 1 мкМ VE-821, 100 нМ BMN-673 или в комбинации в течение 7 дней ( n = 3 биологически независимых эксперимента) . Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Стратегия стробирования проточной цитометрии показана на дополнительном рис. 3D. C) Типичные кривые доза-ответ BMN-673 ± 30 нМ CX-5461. Клеточную пролиферацию измеряли с помощью анализов SRB через 5 дней после обработки.Кривые доза-ответ для BMN-673 корректировали для контроля обработки ДМСО, а комбинацию корректировали на ответ на 30 нМ CX-5461. Представитель трех биологических повторов. Планки погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для n = 5 технических повторений. d Анализ клеточного цикла BrdU клеток, обработанных носителем, 1 мкМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или в комбинации в течение 72 часов, как описано на фиг. 3b и дополнительном фиг. 3D. n = 3, среднее ± SEM. e Время пролиферации in vitro оценивали по слиянию клеток с помощью IncuCyte ZOOM.Представитель n = 3 биологических повтора, среднее значение ± стандартная ошибка среднего из пяти технических повторов. Пунктирными линиями обозначено пополнение среды лекарственными средствами. f CX-5461 и BMN-673 взаимодействуют в подавлении клоногенной выживаемости. Репрезентативное изображение n = 6 биологически независимых экспериментов для клеток OVCAR8 и OVCAR8 RAD51C KO и n = 3 биологических повтора для клеток FT282, среднее значение ± стандартная ошибка среднего. г Клоногенный анализ клеток OV90. n = 3 технические копии.Статистический анализ (в b , d и f ) был выполнен с использованием двустороннего одностороннего дисперсионного анализа, теста множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ).

Затем мы исследовали эффекты комбинирования CX-5461 с BMN-673 на скорость транскрипции Pol I, основываясь на том факте, что ядрышковый PARP1 участвует в регуляции гетерохроматина рДНК ⁴¹ . После 3-часовой обработки CX-5461 мы обнаружили значительное снижение уровней предшественников рРНК (дополнительный рис. 8Б). Однако комбинация CX-5461 с BMN-673 не приводила к дальнейшему снижению количества рРНК по сравнению с образцами, обработанными CX-5461. Таким образом, наши данные предполагают, что CX-5461 взаимодействует с PARPi в индукции остановки роста и гибели клеток за счет усиления репликационного стресса и повреждения ДНК (рис. 7d), в отличие от усиления ингибирования транскрипции Pol I.

CX-5461 обладает значительной терапевтической эффективностью в моделях HGSOC