Лада х рей стоимость: LADA XRAY Cross от 725 310 руб. – Цены и комплектации – Официальный сайт LADA

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus ^cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде стержней) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде стержней) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V ₂₃₂ ADA) образует спираль 3 ₁₀ , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus ^cd (P ₃₀₅ IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus ^cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными элементами, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus ^cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы вычислили коэффициент ориентации κ ² , равный 1,98 (уравнение 1; материалы и методы), и расстояние Ферстера, R ₀ , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus ^cd . Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy ₂ индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, следовательно, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные по жесткой рентгеновской структуре (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Структурный дизайн мутанта с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus ^cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus ^cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей против наблюдаемых RDC и эффективности FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного биосенсора кальция Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His ₇ и расщепляющей последовательностью, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме B834 метионин-ауксотрофа E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www.embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизирующего буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His ₇ отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия на колонке с фенилсефарозой (GE Healthcare) объемом 10 мл. Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония.Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus ^cd после расщепления химотрипсина было выборочно фотообесцвечено (5 мин) с помощью матрицы из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14.7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к перевариванию протеазой. Поэтому EGTA (конечная концентрация 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl ₂ и от 18 до 20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в лунку с добавлением 16-18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным созданием модели вручную с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ ² может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ _T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные расчеты поясняются в файле данных S1. Интеграл перекрытия, J (λ), был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис.S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 ¹⁵ M ⁻¹ см ⁻¹ нм ⁴ , следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F _D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε _A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R ₀ , может быть вычислено из ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q _D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0.979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D ₂ O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами ¹³ C и ¹ H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как ¹² C и протоны как ² H ( 19 ).

Сначала изотропные спектры образцов получали в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ в 100% D ₂ O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D ₂ O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t ₁ ). Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с использованием CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальций-связывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10−318,39 10−323,46 10−318,39 10−32−1,06 10−312,26 10−323,46 10−312,26 10−32−3,92 10−32)

Тензоры даны в м ³ M ⁻¹ .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg ²²⁹ до Gln ²³¹ для mCerulean3 и Met ³¹¹ до Gly ³¹³ для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC.Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC _i — это диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если совпадения предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного совпадения.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q _ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы постоянно подавались в кювету, чтобы минимизировать эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных проводились с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Финансирование: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Мультиплексная 3D-визуализация FRET в глубоких тканях живых эмбрионов

Эксперименты по визуализации и обработка данных

Система FmFLIM-SLOT объединяет измерение времени жизни FmFLIM с частотной разверткой при множественном возбуждении с объемной визуализацией SLOT (дополнительный рисунок S3a).

Измерения параллельных каналов Ex-Em с помощью FmFLIM

FmFLIM одновременно измеряет время жизни флуоресценции в частотной области на нескольких длинах волн возбуждения по принципу спектроскопии времени жизни флуоресценции с преобразованием Фурье ^20,21 .Вместо того, чтобы разделять разные лазерные линии во времени путем включения и выключения лазеров, FmFLIM разделяет лазерные линии возбуждения, запечатывая уникальные частоты модуляции на каждой лазерной линии, так что лазерные линии с разными длинами волн можно различать в частотной области.

Впечатывание частоты осуществляется интерферометром Майкельсона с вращающимся многоугольным зеркалом (48 граней, 55 000 об / мин, диаметр 2,5 дюйма) оптическим рычагом задержки, который генерирует быстрое сканирование разности оптических путей.Когда несколько лазеров возбуждения (на длинах волн 405, 488, 561 и 640 нм) модулируются интерферометром, каждая лазерная линия модулируется с уникальной мгновенной частотой, зависящей от длины волны f = v / λ, где v — мгновенная скорость сканирования оптической задержки интерферометра (дополнительный рисунок S17). Когда модулированный многолинейный лазер используется для возбуждения флуоресцентного образца, фотоны флуоресценции, возбуждаемые определенной лазерной линией, отпечатываются с той же уникальной мгновенной частотой, что и лазер возбуждения, и сигналы фотонов, связанные с каждой линией возбуждения, могут быть считаны с помощью радиочастоты. (RF) понижающее микширование на серии совпадающих частот.Поскольку сигналы нескольких каналов возбуждения имеют различные частоты модуляции и не мешают друг другу во время понижающего РЧ-микширования, несколько каналов возбуждения могут быть активными и обнаруживаться одновременно с помощью принципа мультиплексирования Фурье (частоты модуляции).

В системе FmFLIM фотоны флуоресценции, возбуждаемые несколькими лазерными линиями, дополнительно разделяются по длинам волн излучения и обнаруживаются несколькими детекторами одновременно. Благодаря мультиплексированию возбуждения Фурье и множеству каналов излучения система FmFLIM способна различать фотонные сигналы по спектральным свойствам возбуждения и излучения и параллельно обнаруживать все каналы возбуждения-излучения (Ex-Em).Текущая система FmFLIM способна проводить одновременные измерения на 4 × 4 каналах Ex-Em (спектральная конфигурация показана на дополнительном рисунке S3b), подходящих для большинства распространенных флуоресцентных белков и красителей в видимом диапазоне.

Многоканальные измерения времени жизни в FmFLIM

Время жизни флуоресценции каждого канала возбуждения-излучения измеряется методом времени жизни в частотной области. В дополнение к мультиплексированию Fourier Ex-Em, система FmFLIM также способна выполнять измерения срока службы в нескольких частотных точках в непрерывном диапазоне частот от 10 МГц до максимальной частоты 120–200 МГц в зависимости от длины волны лазера.Эта уникальная особенность обеспечивается оптической линией задержки на основе многоугольного зеркала в интерферометре, скорость развертки задержки которой изменяется линейно от -94 м / с до 94 м / с при частоте повторения 44 кГц. На выходе интерферометра лазерные линии модулируются в циклическую развертку по частоте с максимальными частотами в диапазоне от 120 до 200 МГц (что соответствует лазерной линии 640 нм и 405 нм, соответственно) в пределах 23 мкс (дополнительный рисунок S17). Модуляции с качающейся частотой на четырех лазерных линиях позволяют измерять время жизни флуоресценции в наносекундах со скоростью 44 000 измерений в секунду.

Информация о времени жизни флуоресценции на всех каналах Ex-Em получается параллельно с помощью аналого-цифрового гибридного метода анализа данных, как описано ранее ²¹ (дополнительный рисунок S18). Короче говоря, для генерации сигнала измерения срока службы на заданных длинах волн Ex-Em (λ _x , λ _м ) комбинация фотонного сигнала от ФЭУ на длине волны излучения λ _м и сигнала с фотодиода, который отслеживает частотную модуляцию лазерной линии λ _x отправляются на аналоговый радиочастотный смеситель (Mini-Circuits ZX05-1L-S +), после чего проходит фильтр нижних частот (Mini-Circuits BLP-10.7+) (дополнительный рисунок S18b). Несущая частота результирующего сигнала понижается до 200 ~ 300 кГц. В ФЭУ с λ _m фотонные сигналы, возбуждаемые лазерными линиями, отличными от λ _x , удаляются в процессе понижающего микширования и фильтрации. Только сигнал, возбуждаемый лазерной линией λ _x , участвует в понижающем смешанном сигнале, который содержит информацию о затухании флуоресценции

, где ω — мгновенная частота модуляции лазерной линии λ _x , это РЧ-ответ характеристики электрических цепей в канале Ex-Em, — интенсивность сигнала, m, и ϕ — модуляция и фаза частотных характеристик времени жизни флуоресценции образца, и — несущая частота набора понижающего микшированного сигнала гетеродинным понижающим микшированием.Сигналы понижающего микширования на нескольких каналах Ex-Em записываются одновременно с частотой дискретизации 2 МГц многоканальным высокоскоростным дигитайзером, оснащенным процессором сигналов FPGA (NI 5752 и 7962). Регистрируются 44 точки данных на канал на пиксель, чтобы охватить развертку по частоте в оба конца. Весь сбор данных, аппаратное управление и сканирование изображений выполняются с помощью специального программного обеспечения, написанного в LabVIEW (National Instruments).

Сложный РЧ-отклик системы детектирования, характеризуемый и, может быть предварительно откалиброван стандартами времени жизни флуоресценции с известным временем однократного экспоненциального затухания,

, где H — это преобразование Гильберта, m ^st и ϕ ^st — это модуляция и фазовые характеристики стандарта срока службы, рассчитанные на основе известного единичного экспоненциального срока службы стандарта.После этого откалиброванный ВЧ-отклик системы может быть удален из частотной характеристики затухания образца

. Частотный отклик затухания готов для анализа с помощью либо итеративного подбора методом наименьших квадратов с соответствующими моделями срока службы, либо разработанного нами неитеративного комплексного подхода на основе векторов. для расчета срока службы в реальном времени ³⁷ . Первый метод был использован для анализа всех результатов в этой статье. Последний метод, который может быть реализован в FPGA ³⁷ , может позволить в будущем анализировать трехмерное изображение в реальном времени.

Объемное изображение с помощью SLOT

Для получения трехмерной пространственной информации об образце спектральное измерение FmFLIM было объединено с SLOT, пространственным измерением. Таким образом, данные FmFLIM-SLOT сформировали 6-мерный объем, где x, z, θ — пространственные координаты сканирования томографической проекции.

Для выполнения FmFLIM-SLOT модулированный лазер с выхода интерферометра был слабо сфокусирован в пучок шириной 15 мкм с глубиной фокуса более 1 мм.Луч возбуждал флуорофоры вдоль линии лазерного пути по объему образца. Эмиссия вдоль пути луча собиралась и записывалась в виде одного пикселя на проекционном изображении (дополнительный рисунок S3). В этом исследовании общая мощность нескольких лазерных линий обычно составляла от 0,1 до 0,5 мВт. Из-за слабой фокусировки луча интенсивность возбуждения была намного ниже, чем при конфокальной микроскопии, и у живых эмбрионов не наблюдалось ни фотообесцвечивания флуоресцентных белков, ни фототоксичности.Флуоресцентное излучение собирали под углом 90 градусов от линии лазерного возбуждения с помощью конденсорной линзы (диаметр 1 дюйм, f = 30 мм) и вогнутого зеркала (диаметр 2 дюйма, f = 25 мм). Полный телесный угол сбора флуоресценции составлял 1,32 ср, что эквивалентно углу сбора идеальной линзы с числовой апертурой 0,66. Коллимированные флуоресцентные излучения были разделены на несколько спектральных полос с помощью дихроичных зеркал и полосовых фильтров и обнаружены несколькими детекторами ФЭУ (Hamamatsu 7422). Излученный возбуждающий лазер собирался фотодиодным детектором для формирования пропускающей оптической проекции.

Для получения данных проекции FmFLIM S ( x , z , θ; ω, λ _x , λ _м ) при угле проекции θ, два гальванических зеркала сканировали сфокусированное лазерная линия поперек образца с размером пикселя 10 мкм и скоростью пикселя 44000 пикселей / сек. Образец поворачивали с шагом равного угла между каждым выступом. Обычно было получено 180 проекционных кадров с угловым шагом 2 градуса. Размер кадра 2D-проекции обычно составлял 200 × 350 пикселей (x на z), чтобы покрыть весь эмбрион рыбки данио.Полный набор данных проекции S ( x , z , θ; ω, λ _x , λ _м ) потребовал 12 минут съемки, из которых примерно 5 минут было потрачено на проекцию изображения и остальное при вращении образца. В будущем запись данных и вращение образца можно будет выполнять одновременно, используя спиральную томографию, что позволит сократить время сбора вдвое. Набор данных 6-D проекции S ( x , z , θ; ω, λ _x , λ _м ) был обработан скриптами MatLab (MathWorks) для получения трехмерного мульти- изображения времени жизни флуоресценции канала.

Обработка данных FmFLIM-SLOT

Поскольку пространственные размеры ( x , z , θ) и временные / спектральные размеры (ω, λ _x , λ _м ) ортогональны, временная / спектральная и пространственная обработка не мешают друг другу. Аналогично одноканальной томографии FLIM ^11,12 , данные FmFLIM-SLOT S ( x , z , θ; ω, λ _x , λ _м ) впервые прошли реконструкция пространственной томографии и была преобразована в S ( x , z , y ; ω, λ _x , λ _м ).Затем S ( x , z , y ; ω, λ _x , λ _м ) был подвергнут анализу срока службы по спектральным размерам (дополнительный рисунок S18b).

Реконструкция томографии требует известного центра вращения. Центр вращения предметного столика относительно проекционных изображений сначала был измерен с помощью фантома флуоресцентных шариков ⁴⁰ перед визуализацией in vivo .

После восстановления томографии данные многоканального затухания реконструированных вокселей были скорректированы с учетом РЧ-ответа системы, как описано ранее, согласно уравнениям (1, 2, 3).Скорректированные данные затухания были проанализированы с помощью итеративного подбора методом наименьших квадратов с одноэкспоненциальной моделью времени жизни в частотной области, что дало значения интенсивности I ( x , z , y ; λ _x , λ _m ) и средний срок службы τ ( x , z , y ; λ _x , λ _м ) на нескольких каналах Ex-Em. Когда образец эмбриона содержал один датчик FRET, изображение времени жизни донорского канала служило индикатором эффективности FRET.Для визуализации с двойным датчиком FRET, в котором два датчика имели спектрально перекрывающиеся флуорофоры, использовался комбинированный метод анализа интенсивности-времени жизни для обработки трехканального I ( x , z , y ; λ _x , λ _м ) τ ( x , z , y ; λ _x , λ _м ) объемов и для получения индивидуальных показаний для каждого датчика FRET (дополнительные примечания ).

Визуализация трехмерных объемов времени жизни

Трехмерные объемные данные интенсивности и срока службы были визуализированы в двухмерные проекции для визуализации. Для проекций интенсивности трехмерные объемы всех спектральных каналов были визуализированы индивидуально в 2D-проекции интенсивности с помощью метода проекции максимальной интенсивности (MIP), а затем объединены в 2D-проекции интенсивности в псевдоцвете. 2D-проекции времени жизни были визуализированы из 3D-объемов интенсивности-времени жизни с помощью модифицированного алгоритма MIP, который рассчитывал проекции срока службы как средневзвешенные по интенсивности всех слоев и представлял среднее проекционное изображение в течение всего срока службы на шкале ложных цветов с интенсивностью MIP, отображаемой как яркость.

Вся реконструкция изображений, анализ данных и визуализация данных были выполнены с использованием собственного программного обеспечения, реализованного в MatLab (Mathworks Inc.).

Процедуры для рыбок данио

Разведение и содержание рыбок данио

Рыбки данио ( Danio rerio ) выращивались и содержались в соответствии с описанием ⁴¹ . Для получения трансгенных рыбок данио использовали лабораторно инбредный штамм дикого типа AB *. Эмбрионы собирали после естественного нереста, выращивали при 28,5 ° C и стадировали в соответствии с часами после оплодотворения (hpf) до 10 hpf.Затем эмбрионы хранили при комнатной температуре для замедления развития и увеличения временного окна визуализации. Стадии развития эмбрионов оценивали по наблюдениям. Через 20 часов после оплодотворения эмбрионы переносили в среду для эмбрионов, содержащую 0,2 мМ 1-фенил-2-тиомочевину, чтобы предотвратить пигментацию. Все процедуры на животных и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8 ^{-е издание} )». Протокол использования животных был одобрен Университетским комитетом по использованию и уходу за животными Мичиганского университета (протокол № 4478).

Инъекция красителей для четырехцветных рыбок данио

Cy5-конъюгированный декстран 500 кДа (0,5 мг / мл) вводили подкожно в область заднего туловища 72 hpf трансгенному Tg ( enpep: GFP; pod: nfsB-mCherry ) личинки данио. После инъекции личинок окрашивали 100 мкМ Syto 41 (Life Technologies) в течение 30 минут ²⁶ и трижды промывали зародышевой средой перед визуализацией.

Промотор клонирования и конструирование плазмид

Промоторы enpep были амплифицированы из геномной ДНК рыбок данио с помощью ПЦР и клонированы в вектор p5’E в наборе Tol2 gateway (любезно предоставленном Drs.Чи-бин Чиен и Кристен Кван) ⁴² . Ген rtTA и промотор Tet-ON ( P _Tight ) были амплифицированы из pRetroX-Tet-OnAdvanced и pRetroX-Tight-Pur (Clontech) и клонированы в pME и p5’E в наборе Tol2 gateway. соответственно. Датчик GEpacmC был щедрым подарком от доктора Киса Джалинка ⁴³ . Сенсор кальция CD2V был получен от Addgene (плазмида № 37471).

Трансгенные конструкции были получены в соответствии с опубликованной процедурой для набора шлюзов Tol2 (http: // tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page).

Создание трансгенных рыбок данио и микроинъекция

Кепированная РНК, кодирующая транспозазу Tol2, была синтезирована из линеаризованной плазмиды с использованием набора для синтеза РНК mMessage mMachine T3 (Ambion) посредством транскрипции in vitro . Для создания трансгенных рыбок данио конструкцию ДНК вводили совместно с РНК, кодирующей транспозазу Tol2, в оплодотворенные яйца. Эмбрионы, экспрессирующие трансген, выращивали до зрелого возраста и скрещивали с рыбками данио дикого типа для получения трансгенных животных зародышевой линии.Экспрессию сенсора индуцировали обработкой 10 мкг / мл доксициклина (Sigma) в течение ночи. Поскольку доксициклин имеет сильную флуоресценцию при возбуждении 405 нм, эмбрионы замачивали и промывали в среде для эмбрионов в течение 30 минут перед визуализацией.

Генерирование тройных трансгенных рыбок данио с индуцибельной экспрессией сенсоров CD2V и GEpacmC