Лада гранта предохранители: Страница не найдена — Промышленные Машины

Содержание

Предохранители и реле Лада Гранта.

Предохранители и реле Лада Гранта.

Схема Лада Гранта.

Плавкие предохранители и реле включения электрооборудования установлены в монтажном блоке. Монтажный блок предохранителей и реле установлен в панели приборов с левой стороны.

Монтажный блок предохранителей и реле:

1 — реле включения электровентилятора системы охлаждения двигателя, К1;

2 — реле включения дальнего света фар, К7;

3 — реле включения звукового сигнала, К8;

4 —реле включения стеклоподъемников дверей, К2;

5 — реле стартера К3;

6 — реле включения дальнего света фар, К7;

7 — дополнительное реле, К15/1;

8 — реле включения обогрева заднего стекла, К10

;

9 — реле включения указателей поворота и аварийной сигнализации, К5;

10 — главное реле системы управления двигателем, К11

11 — реле включения стеклоочистителя, К6

12 — реле включения топливного насоса, К12;

13 — пинцет для извлечения предохранителей;

14 — пинцет для извлечения реле;

15 — запасные предохранители F27F30;

16 — рабочие предохранители F1F26.

Примечание.  На корпусе монтажного блока указаны порядковые номера предохранителей и реле. Назначение реле и защищаемые предохранителями цепи обозначены условными символами на внутренней стороне накладки панели приборов, которая закрывает место установки предохранителей. Там же для предохранителей указана сила тока. Слева от блока могут быть установлены дополнительные реле.

Применяемость и назначение реле монтажного блока.

Обозначение Назначение
K1 2110-3747210-31 Реле электровентилятора системы охлаждения двигателя
K2 2110-3747210-31 Реле включения блокировки дверей
K3 2110-3747210-11 Дополнительное реле стартера
K4 (40 A) 2170-3747310-00 Дополнительное реле
K5 1117-3747010-00 Реле – прерыватель указателей поворота и аварийной сигнализации
K6 2114-3747710-00 Реле стеклоочистителя
K7 1119-3747210-10 Реле включения дальнего света фар
K8 1119-3747210-10 Реле звукового сигнала
K9 1119-3747210-10 Реле включения ближнего света фар
K10 1119-3747210-10 Реле включения обогрева заднего стекла
K11 1119-3747210-10 Реле главное
K12 1119-3747210-10 Реле топливного насоса

Предохранители и защищаемые цепи.

Ток, А Защищаемые цепи
F1 15 Электронный блок управления двигателем, реле электровентилятора системы охлаждения, топливные форсунки
F2 30 Электростеклоподъемники
F3 15 Аварийная сигнализация
F4 20 Стеклоочиститель, подушка безопасности
F5 7,5 Реле (клемма 15)
F6 7,5 Фонарь заднего хода
F7 7,5 Электронный блок управления двигателем
F8 25 Обогрев заднего стекла
F9 5 Лампы габаритного света с правой сторо­ны автомобиля
F10 5 Лампы габаритного света с левой стороны автомобиля
F11 5 Фонарь заднего противотуманного света
F12 7,5 Лампа ближнего света правой блок-фары
F13 7,5 Лампа ближнего света левой блок-фары
F14 10 Лампа дальнего света правой блок-фары
F15 10 Лампа дальнего света левой блок-фары
F16   Резерв
F17   Резерв
F18   Резерв
F19   Резерв
F20 15 Звуковой сигнал, прикуриватель, замок ба­гажного отделения, диагностический разъем
F21 15 Топливный насос
F22 15 Блок дистанционного управления централь­ным замком
F23 10 Лампы дневных ходовых огней
F24   Резерв
F25 10 Плафон освещения салона, сигналы торможения
F26   Резерв
F27   Запасной
F28   Запасной
F29   Запасной
F30   Запасной
F31   Резерв
F32
30
Электроусилитель рулевого управления*, климатическая установка

Примечание. При замене предохранителей следует руководствоваться условными обозначениями на крышке монтажного блока.

* Устанавливается на часть автомобилей.

Поделиться ссылкой:

Похожие статьи

Блок предохранителей Лады Гранты и обозначение

Все детали и узлы электрической цепи автомобиля Лада Гранта защищены плавкими предохранителями. Это необходимо для того, чтобы в случае возникновения чрезмерной нагрузки или короткого замыкания, весь удар на себя брал предохранитель, а основное устройство при этом останется целым и невредимым.

Где находится монтажный блок предохранителей на Гранте

Местоположение блока примерно такое же, как и на предыдущей модели — Калины. То есть, с левой стороны вблизи блока управления светом. Чтобы показать все это более наглядно, ниже будет представлено фото его нахождения:

Каждое посадочное место предохранителя в монтажном блоке обозначено латинскими буквами F под своими порядковым номером. А какой предохранитель за что отвечает, можно посмотреть в приведенной ниже таблице.

Данная схема представлена с официального сайта производителя Автоваза, поэтому к ней стоит отнестись с доверием. Но все же, стоит иметь ввиду, что в зависимости от комплектации и варианта исполнения автомобиля, монтажные блоки могут быть незначительно изменены и порядок расположения плавких элементов не такой, как приведен ниже.

Но такие случаи бывают крайне редко, так что можно ориентироваться по приведенной ниже таблице.

№ предохра-нителяСилатока, АЗащищаемые электрические цепи
F115контроллер, реле вентилятора охлаждения двигателя, КЗ 2х2, форсунки
F230стеклоподъемники
F315аварийный сигнал
F420стеклоочиститель, НПБ
F57,515 клемма
F67,5свет заднего хода
F77,5клапан адсорбера, ДМРВ, ДК 1/2, датчик скорости
F830обогрев заднего стекла
F95габаритный огонь правый
F105габаритный огонь левый
F115задний противотуманный огонь
F127,5ближний свет правый
F137,5ближний свет левый
F1410дальний свет правый
F1510дальний свет левый
F2015звуковой сигнал, замок багажника, КП, прикуриватель, диагностический разъем
F2115бензонасос
F2215центральный замок
F2310ДХО
F2510плафон освещения салона, стоп-сигнал
F3230отопитель, ЭУРУ

В монтажном блоке находится пара пинцетов, которые предназначены специально для извлечения сгоревших предохранителей. Если с помощью них извлечь не получается, можно поддеть предохранители аккуратно отверткой с плоским лезвием.

Стоит отметить, что вместо вышедших из строя предохранителей на Гранте, необходимо строго устанавливать только номинальной силы тока, иначе возможны два пути развития событий:

  • Если поставить меньшей мощности, они могут постоянно перегорать.
  • А если поставить наоборот большей мощности, то это может привести к замыканию и возгоранию проводки, а также выходу из строя определенных электрических элементов.

Также, не стоит вместо предохранителей устанавливать самодельные перемычки, как многие привыкли делать, это может стать причиной выход из строя системы электрооборудования.

ПОХОЖИЕ СТАТЬИ

Блок предохранителей ВАЗ / Lada 2190 (Granta)

Номер Номинальный ток, A Назначение предохранителя
     
Блок предохранителей расположенных под панелью управления
F1 15 Электронный блок управления двигателем (далее — ЭБУ)
Вентилятор системы охлаждения — реле
Топливные форсунки 
F2 30 Электростеклоподъёмники
F3 15
Аварийная сигнализация
F4 20 Очиститель ветрового стекла
Подушка безопасности
F5 7,5 Реле — клемма 15
Очистители и омыватели заднего стекла — переключатель
F6 7,5 Задний ход — фонари
F7 7,5 ЭБУ
F8 25 Обогрева заднего стекла
F9 5 Габаритные огни — правый борт
F10 5 Габаритные огни — левый борт
F11 5 Задние противотуманные фонари
F12 7,5 Ближний свет — правая фара
F13 7,5 Ближний свет — левая фара
F14 10 Дальний свет — правая фара
F15 10 Дольний свет — левая фара
F16 Резерв
F17 Резерв
F18 Резерв
F19 Резерв
F20 15 Звуковой сигнал
Прикуриватель
Замок багажника
Диагностический разъём
F21 15 Топливный насос
F22 15 Блок управления центральным замком
F23 10 Дневные ходовые огни
F24 Резерв
F25 10 Освещение салона
Стоп-сигнал
F26 Резерв
F31 Резерв
F32 30 Блок управления электромеханическим усилителем руля
Климатическая установка

Есть ли ГУР на ладу гранту.

Все об установке электроусилителя руля на ладу гранту в гараже

Установка ЭУР на Granta Standard — частая причина обращения владельцев данных автомобилей в автосервис. Однако при должной сноровке вы легко сможете сделать это самостоятельно. Как установить такую ​​систему, если у вас Лада Гранта и стоит ли вообще это делать — читайте в статье.

[Скрыть]

Стоит ли устанавливать электроусилитель руля

Езда без гидроусилителя, конечно, возможна.Однако если вы ранее ездили на автомобиле, оснащенном такой системой, то можете испытывать серьезный дискомфорт. Вы будете лишены привычной поддержки электродвигателя.

Установка такого механизма сложна и дорога. Но все они окупятся комфортной ездой и повышенной безопасностью для вас и ваших пассажиров.

Таким образом, ответ на вопрос «Стоит ли устанавливать?» — это однозначное «Да». Даже если вы не хотите делать это самостоятельно, обратитесь в автосервис.

В видео ниже вы найдете сравнение преимуществ ГУР и ЭУР (автор видео АВТОТЕМА ТВ).

Возможные неисправности ЭУР

Бывает так, что после установки ЭУР не работает вообще или с перебоями.

Это может быть вызвано разными причинами, среди которых чаще всего выделяются две:

  1. Поломка датчика скорости. в связи с датчиком скорости. На высокой скорости дополнительное усилие от механизма уменьшается, чтобы дать вам больше контроля.Если данные с датчика перестанут поступать, ЭУР автоматически отключится. Проблема решается заменой датчика.
  2. Неправильно установленный картер. При нарушениях в установке картера (кожуха) двигателя вибрации от мотора будут передаваться на усилитель. Он начнет гудеть, в некоторых случаях даже выключаться.

Инструкции по установке


Это руководство предназначено для тех, кто имеет минимальный опыт работы с инструментами и системами автомобиля.Он сделан максимально доступным для всех. Но если вы сомневаетесь в своих навыках и знаниях, лучше обратиться в автосервис.

Необходимые инструменты и материалы

В первую очередь нужен сам ЭУР. Обратите внимание на его серийный номер. Последние две цифры обозначают тип и место производства.

Итак, 00 — усилитель коробки передач, произведен в Махачкале и имеет нарекания водителей. С номерами 04 — кореец, ставился на Гранты и Калины, хороший усилитель, в магазинах можно найти, но на развалинах его не много.Ну и 02 — Калуга, безредукторного типа, тоже хорошие отзывы.

Для соединения потребуются такие обычные инструменты, как отвертки, гаечные ключи, болгарка.

Процесс установки

Сначала нужно будет полностью снять такие элементы, как подушка, руль, переключатели, замок зажигания, а в конце рулевая колонка вместе с кронштейном и карданом.

  1. Взяв старый кронштейн-пластину, выбить из него болты. Затем отрежьте примерно 30 мм сверху (где приварены 2 болта и есть 3 отверстия).
  2. Примерить пластину для ЭУР, если отверстия не совпадут (скорее всего совпадут), просверлить.
  3. Теперь вам нужно прикрепить стабилизатор к усилителю.
  4. Шайбы должны располагаться под кронштейном в месте крепления к усилителю. Они бывают разной толщины и напрямую влияют на будущие регулировки рулевого управления.
  5. Теперь можно исправить ЭУР. Вставьте кардан в рейку.

После всего этого нужно подключить проводку.Ниже приведена схема подключения.


Регулировка рулевого колеса

Как упоминалось выше, шайбы влияют на то, насколько рулевая колонка будет прогибаться вверх и вниз. Они устанавливаются между кронштейном и усилителем. Величина прогиба рулевой колонки зависит от их толщины.

Видео «Установка электроусилителя руля»

В этом видео рассказывается о плюсах и минусах такой системы, а также подробно демонстрируется процесс установки (автор видео — sokur64).

Руль Гранта и ВАЗ 2114 — важный элемент управления автомобилем. наиболее распространены в этой системе? Какие есть способы обновить узел? Прежде чем ответить на эти вопросы, нужно четко понимать, что такое рулевое управление.

На сегодняшний день две последние разработки отечественного предприятия и ВАЗ 2114 являются безоговорочными лидерами на российском рынке… Оригинальные, стильные, мощные, эти автомобили заслуживают особого внимания и положительной оценки. Собранные по новой технологии Гранта и ВАЗ 2114 вызвали широкий интерес у автомобилистов.Но, конечно же, у любой, даже самой лучшей, разработки есть свои недостатки, о которых следует знать владельцу во избежание каких-либо проблем при эксплуатации. В частности, рулевое управление может преподнести много сюрпризов.

Функции рулевого управления

Рулевое управление — это система, которая приводит в движение транспортное средство. Она состоит из рулевого колеса, рейки, механизма и привода. Принцип действия рулевого колеса основан на том, что руль воспринимает импульс усилия водителя и передает его механизму, который реагирует в соответствии с заданным водителем направлением.То есть, когда водитель поворачивает руль, он передает усилие поворота на механизмы, которые связаны с передними колесами, так происходит движение.

Устройство рулевого механизма Лада Гранта

Руль легкового автомобиля отличается от руля грузового автомобиля прежде всего диаметром. В первом случае это 390-420 мм, во втором — 445-545 мм. У спорткаров руль меньше стандартного, установленного на обычную легковушку…Кроме диаметра есть разница в механизме управления.

На сегодняшний день существует несколько типов рулевой колонки, от обычных и недорогих до типа, позволяющего складывать ее в высокой степени при лобовом ударе. Кроме того, рулевые колонки имеют как механическую, так и электрическую регулировку, что очень удобно, когда нужно отрегулировать высоту руля или его направление.

В образцах последних лет, принадлежащих, имеется рулевая колонка, которая легко переставляется с места водителя на место правого пассажира.Рулевой механизм — устройство, передающее колебания от силы воздействия на рулевую колонку на привод.

Существует несколько типов рулевого механизма, самый распространенный из которых — реечный.

Также встречается в российских моделях Лада Калина, Гранта, ВАЗ 2114 и других проектах АвтоВАЗа. А вот легендарные BMW, Toyota, Mazda и другие оснащены более сложным рулевым механизмом, с принципом работы на все четыре колеса. Это решение гарантирует большую стабильность и отличную управляемость.

Привод передает мощность от рулевого механизма на колеса. На сегодняшний день известно несколько конструкций приводов, в зависимости от того, какая именно. Наиболее популярным и известным является механический привод, который состоит из шарниров и тяг. Такой тип конструкции встречается как в российских моделях, таких как Гранты, так и в европейских проектах.

Типы рулевого управления с усилителем

Типовая конструкция рулевого управления с гидравлическим усилителем

Усилитель применяется для повышения эффективности и комфорта рулевого управления.Механизмы делятся на три вида:

Электроусилитель руля работает от электричества и имеет достаточно сложную конструкцию. ЭУР значительно улучшает динамику, маневренность, управляемость автомобиля, в некоторых случаях даже позволяет. Электроусилитель руля сегодня имеется не только в иномарках, как это было десять лет назад, но даже в отечественных моделях, таких как . Купить его можно в любом автомагазине страны.

Принцип работы гидроусилителя руля заключается в подкачке гидравлической жидкости… Усилитель мощности обладает хорошей способностью амортизировать удары, приходящиеся на руль при движении на высокой скорости по ухабистым дорогам. Механизм также улучшает маневренность. Единственное, чем он может уступать электрическому усилителю, так это тем, что он не экономичен, а более эффективен и надежен. Пневмоусилитель — современный вариант, еще редко встречающийся в автомобилях и уж тем более не встречающийся в отечественных проектах, хотя купить его уже можно в крупных автосалонах.

Особенности рулевого управления Гранты

Рулевое колесо от Гранты — стандартное, реечного типа, привод состоит из двух рулевых тяг, объединенных в единую конструкцию за счет шаровых опор. В теории это неплохо, но практика показывает обратное. Отверстия для рулевой тяги невероятно велики, что хорошо для воздухообмена, но плохо для загрязнения. Удивительно, но столь практичные мастера АвтоВАЗа как-то раньше не задумывались над этим насущным вопросом. Для исправления этого дефекта многие автовладельцы устанавливают простые заглушки на рулевые тяги Лады.

Чаще всего руль от Гранты страдает расшатыванием креплений. Что можно сделать в этом случае? Только гайки надо сильнее затянуть.Также можно отметить возникновение стуков на руле. Для устранения проблемы стоит подтянуть гайки, если они ослабли, или заменить детали, если при осмотре вы обнаружите, что они изношены. При тугом вращении руля Лада Гранта придется менять подшипник. В некоторых случаях необходимо отремонтировать стойку подвески и смазать детали.

Фото и видео обзор салона автомобиля Лада Гранта
Какая максимальная скорость Лада Гранта люкс?
Как снизить расход топлива автомобиля Lada Granta

Установка ЭУР на Гранта Стандарт — частая причина обращения владельцев этих автомобилей в автосервис. Однако при должной сноровке вы легко сможете сделать это самостоятельно. Как установить такую ​​систему, если у вас Лада Гранта и стоит ли вообще это делать — читайте в статье.

Стоит ли устанавливать электроусилитель руля

Езда без усилителя руля, конечно, возможна. Однако если вы ранее ездили на автомобиле, оснащенном такой системой, то можете испытывать серьезный дискомфорт. Вы будете лишены привычной поддержки электродвигателя.

Установка такого механизма сложна и дорога.Но все они окупятся комфортной ездой и повышенной безопасностью для вас и ваших пассажиров.

Таким образом, ответ на вопрос «Стоит ли устанавливать?» — это однозначное «Да». Даже если вы не хотите делать это самостоятельно, обратитесь в автосервис.

В видео ниже вы найдете сравнение преимуществ ГУР и ЭУР (автор видео — АВТОТЕМА ТВ).

Возможные неисправности ЭУР

Бывает так, что после установки ЭУР не работает вообще или с перебоями.

Это может быть вызвано различными причинами, среди которых чаще всего выделяют две:

  1. Поломка датчика скорости. Электроусилитель руля работает в связке с датчиком скорости. На высоких скоростях дополнительное усилие от механизма уменьшается, чтобы дать вам больше контроля. Если данные с датчика перестанут поступать, ЭУР автоматически отключится. Проблема решается заменой датчика.
  2. Неправильно установлен картер. При нарушениях в установке картера (кожуха) двигателя вибрации от мотора будут передаваться на усилитель.Он начнет гудеть, в некоторых случаях даже выключаться.

Инструкции по установке

Это руководство предназначено для тех, кто имеет минимальный опыт работы с инструментами и системами автомобиля. Он сделан максимально доступным для всех. Но если вы сомневаетесь в своих навыках и знаниях, лучше обратиться в автосервис.

Необходимые инструменты и материалы

В первую очередь нужен сам ЭУР. Обратите внимание на его серийный номер. Последние две цифры обозначают тип и место производства.

Итак, 00 — это усилитель коробки передач, производства Махачкалы и имеет нарекания водителей. С номерами 04 — кореец, ставился на Гранты и Калины, хороший усилитель, в магазинах можно найти, но на развалинах мало. Ну и 02 — Калуга, безредукторного типа, тоже хорошие отзывы.

Для соединения потребуются такие обычные инструменты, как отвертки, гаечные ключи, болгарка.

Процесс установки

Сначала нужно будет полностью снять такие элементы, как подушка, руль, переключатели, замок зажигания, а в конце рулевая колонка вместе с кронштейном и карданом.

  1. Взяв старый кронштейн-пластину, выбить из него болты. Затем отрежьте примерно 30 мм сверху (где приварены 2 болта и есть 3 отверстия).
  2. Примерить пластину для ЭУР, если отверстия не совпадут (скорее всего совпадут), просверлить.
  3. Теперь вам нужно прикрепить стабилизатор к усилителю.
  4. Шайбы должны располагаться под кронштейном в месте крепления к усилителю. Они бывают разной толщины и напрямую влияют на будущие регулировки рулевого управления.
  5. Теперь можно зафиксировать евро. Вставьте кардан в рейку.

После всего этого нужно подключить проводку. Ниже приведена схема подключения.

Схема подключения

Регулировка рулевого колеса

Как упоминалось выше, шайбы играют роль в том, насколько рулевая колонка будет прогибаться вверх и вниз. Они устанавливаются между кронштейном и усилителем. Величина прогиба рулевой колонки зависит от их толщины.

Видео «Установка электроусилителя руля»

В этом видео рассказывается о плюсах и минусах такой системы, а также подробно демонстрируется процесс установки (автор видео — sokur64).

Комментарии и отзывы

Иван Иванович Баранов

Стаж работы на СТО:

Просмотреть все ответы

Автозам.ком ваш помощник в ремонте и обслуживании автомобилей

Использование вами этого веб-сайта означает ваше согласие с тем, что вы используете его на свой страх и риск.

Рулевое управление автомобиля ВАЗ 2114 с самого его производства предполагало возможность установки гидроусилителя руля с помощью монтажного комплекта. .. Это касается и электроусилителя руля или просто ЭУР.

Данная модификация облегчит поворот автомобиля и повысит комфорт вождения. Особенно это касается водителей, которые большую часть времени ездят по городу.

Основное отличие ГУРа от ЭУР в том, что сила (КПД) первого напрямую зависит от оборотов мотора. На высокой скорости крутить руль слишком легко. Это влияет как на ощущения от езды, так и на управляемость.

Для преодоления таких проблем усилитель руля подключается не напрямую к двигателю, а с помощью регулятора усиления. Именно такой функциональностью обладает электрический усилитель. Работа ЭУР не характеризуется прямой зависимостью между усилием и мощностью двигателя, что позволяет включать его в работу по мере необходимости в конкретной ситуации.

Для ВАЗ 2114 подходит аналогичный ЭУР, что и для Лада Приора.

Дополнительные преимущества использования электроусилителя вместо ГУР:

  • Меньше требований к техническому обслуживанию (нет необходимости следить за маслом, соединениями).
  • В мороз не нужно прогревать, как при использовании гидроусилителя руля.
  • Установить ЭУР намного проще (не нужно будет вмешиваться в моторный отсек).
  • Высокая надежность.
  • Единственный минус — меньшая мощность, хотя на легковушках типа ВАЗ 2114 это совсем не заметно.

Ответ уникален для каждого автолюбителя. С одной стороны, руль становится легким и эффект действительно заметен.С другой стороны, помимо финансовой стороны вопроса (а это минимум 15-20 тысяч рублей), на его установку потребуется потратить целый день. Выбор полностью за вами, но если вы все-таки решились, мы поможем вам с установкой.

  1. Сам электроусилитель;
  2. Блок управления;
  3. Промвал;
  4. Электропроводка.

При установке электроусилителя необходимо учитывать, что потребуется замена рулевой колонки ВАЗ 2114 на «электроколонку».Для этого начнем с проводки. Вам нужно будет разобраться с накладками. Никаких «наворотов» не понадобится. В колодке есть клемма, которую нам нужно снять и вставить на колодку в жгуте.

Вставляем свободную клемму жгута ровно в то место, где был штатный провод. Специальный жгут для этого не нужен. Подсоедините два провода 4-квадрата к аккумулятору. Не забудьте подключить предохранитель на 50А. «Слабо» будет подключаться к тахометру, датчику скорости, массе, К-линии и проводке на контрольной лампе. Не забудьте проверить наличие сигналов со спидометра и тахометра.

  1. Снимите крышку с переключателей и замка зажигания.
  2. Открутите болт на рейке и снимите ее. Нужно определить, насколько «родная» деталь больше нашей новой.
  3. Устанавливаем вал на ЭУР. После этого прикрепляем вал на место.
  4. Настраиваем проводку. Протягиваем два тросика к аккумулятору из салона, желательно через левое крыло.Для публикации вы можете:
  • Сначала снимите бачок омывающей жидкости.
  • Возьмите жесткий провод и протяните его, пытаясь добраться до капота.
  • Как только он появится у капота, прикрепляем к нему наши провода.
  • Вытаскиваем вместе с нашим проводом.
  1. Подключаем электронику ЭУР. Под приборной панелью красная колодка, а в ней оранжевый провод. Именно к нему нужно подключить электроусилитель.
  2. Аналогичные процедуры необходимо выполнить с серым проводом.
  3. Подключаем силовые концы. Подключаем розовый к аккумулятору, это плюс, а черный минус.

Установка завершена. Если вы все сделали аккуратно по инструкции, то получите удовольствие от легкости управления ВАЗ 2114.

Если вас не устраивает высота и положение руля, то вам нужно будет стачивать края лопастей до нужного вам размера или установить проставки между накладкой и кузовом.Стоит помнить, что электроусилитель руля автоматически отключается на скорости выше 50 км/ч, в отличие от того же ГУР.

Установить электроусилитель руля самостоятельно вполне реально. Стоит только помнить, что даже с опытным водителем это займет много времени и сил. Но для любителя комфортной езды результат оправдает все затраты и ожидания.

ЧТО ТАКОЕ ПОД ПАНЕЛЬЮ?

Розетка под панелью — разъем для подключения проводов.

В магазине мне предложили купить ЭУР от калины. Приора не было. Так какой купить?

На ваз 2114 какой установить электрический уселитель? От приоры или от калины.

Ставка от приоры.

Покупайте от приоры, ибо не факт что калина сядет без проблем.

с какой машины можно поставить сиденье на ваз2114

От Приоры, Гранты, от Рекаро

Добрый день. Подскажите пожалуйста следующую ситуацию ВАЗ 2114 1.6. 8 кл. Двигатель не запустится, пока не будет нажата педаль акселератора. В 3-х мастерских все выглядело нормально, говорят еще никого не видели. Электронная педаль. Пробег 14тыс. Спасибо.

Здравствуйте! У меня такая проблема, купил машину, ВАЗ 2115, с уже установленным электроусилителем. В последнее время стал глючить (иногда не включался при запуске, перезапуск машинка начинает работать), а сейчас заводится вообще не включается. Подскажите пожалуйста, каковы причины и меры по их устранению?

Обрыв проводки или неисправность двигателя.

привет. подскажите почему светодиод в ключе зажигания на ваз 2114 не гаснет, даже если ключ вытащить.

ДОБРЫЙ ДЕНЬ КУПИЛ ЕВРО У ПРИОРЫ ТЕПЕРЬ ХОЧУ УСТАНОВИТЬ НА ВАЗ 2114. СОВЕТУЮ ГДЕ КУПИТЬ СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ ПРОВОДА И ПЛАСТИНУ С КАРДАНИКОМ. НАПИШИТЕ ПОЖАЛУЙСТА

Автомобили ВАЗ 2110

оснащены электроусилителем руля, что невероятно радует водителей. Это дополнение значительно улучшает маневренность и управляемость автомобиля, что позволяет водителю чувствовать себя более уверенно на дороге.

Кроме того, водителю не нужно прилагать много усилий на руль, что дает возможность совершать длительные поездки, не чувствуя усталости.

Электроусилитель руля на автомобили ВАЗ 2110 при необходимости можно установить самостоятельно, но для этого нужно разобраться в устройстве.

Еще в 2002 году инженеры Новосибирского технического университета разработали ставший таким популярным электроусилитель руля. После того, как все этапы создания устройства были пройдены, в течение нескольких лет устройство тестировалось на заводе ВАЗ.

Российские производители сделали все, чтобы обеспечить надежные и качественные преимущества агрегата перед аналогичными устройствами зарубежного производства. Усилитель использует переменный ток для обеспечения надежности и долговечности.

Приора электроусилитель руля схема

Но главным для наших водителей была приемлемая стоимость этого агрегата, намного ниже, чем у западных комплектующих. Кроме того, электроусилитель может стать надежным защитником от угона. Так как электроусилители были придуманы для отечественных марок, то и производятся они, соответственно, в России, на Бердском электромеханическом заводе, который стал дочерним предприятием ВАЗа.

Сам электроусилитель руля был впервые изобретен и внедрен еще в 1990 году в Японии на заводах концерна Toyota. Первые преимущества прибора, которые он показал, характеризовались следующими показателями:

  • Установка работает даже при выключенном двигателе;
  • Во время работы компонентов может наблюдаться значительная экономия топлива в течение определенного периода времени;
  • Значительно улучшены все показатели управляемости;
  • Надежность управления достигает больших высот;
  • Создает хорошие условия безопасности при постоянной езде.

Нужно понимать, что ГУР есть ГУР и эти два устройства постоянно сравнивают, выясняя, какое из них лучше. В общих чертах можно сказать, что эти два компонента могут иметь общие показатели, но электроусилитель имеет в своем составе электронный блок.

Именно это отличие делает его более функциональным, а его работоспособность характеризуется следующими показателями:

  • Датчики электронного блока постоянно контролируют показатели скорости движения, считывают его траекторию и контролируют исправность рабочих узлов;
  • После сбора данных они передаются в специальный электронный блок управления, где обрабатываются;
  • Искусственный интеллект системы управления изменяет параметры главного цилиндра в автоматическом порядке;
  • Уровень давления масла регулируется только положением клапана, он может быть как открытым, так и закрытым;
  • Чем большую скорость начинает набирать автомобиль, тем интенсивнее и активнее открывается клапан;
  • В процессе увеличения скорости параллельно увеличивается и острота рулевого управления, а это, в свою очередь, повышает степень безопасности и устойчивости при управлении автомобилем ВАЗ 2110;
  • Кроме того, наличие топлива не влияет на работу электроусилителя, не влияет на его расход.

Работа ЭМУРУ, то есть электромеханического усилителя руля, направлена ​​на снижение управляющих усилий водителя. Также устройство предназначено для активного возврата управляемых колес и руля в исходное положение после совершения маневра. Меньшее количество поворотов руля вернет колеса в исходное положение.

Благодаря устройству автомобиль быстро возвращается к прямолинейному движению, что обеспечивает безопасность вождения.

Сам блок представляет собой модульную конструкцию, встроенную в рулевую колонку.

Модуль состоит из двух основных компонентов:

  • Силовая установка представляет собой электротехническое устройство синхронного характера;
  • Контроллер типа управления.

Установка электроусилителя особенно актуальна, если владелец ВАЗ 2110 устанавливает более широкие шины на колеса большого диаметра, по сравнению со стандартными заводскими. Такая проблема, как «шалящий» руль в случае электроусилителя исключена, руль слушается водителя даже при легком касании.

Общая схема электроусилителя руля

Если раньше водителю приходилось постоянно держать руль двумя руками и прикладывать много усилий, чтобы его повернуть, то теперь все можно сделать одним пальцем.

Благодаря этим показателям ВАЗ 2110 считается одним из самых безопасных автомобилей на отечественных дорогах.

Как и любой другой модуль в автомобиле, электроусилитель имеет свои показатели, которые необходимо учитывать. Чтобы было понятно, что это за агрегат, следует привести его технические характеристики:

  • Максимальная компенсация крутящего момента 35 Нм;
  • Потребляемый ток при среднем Mmax = 35 Нм и скорости вращения руля 360 градусов в секунду составляет 50А;
  • Диапазон рабочих температур от — 40 до + 85 градусов Цельсия;
  • Общий вес узла
  • равен 9.5 килограммов;
  • Двигатель с электронным управлением-реактивный индуктор;
  • Вращение реверсивное;
  • Наличие трех фаз;
  • Установлена ​​червячная передача с тремя проходами;
  • Червячный вал изготовлен из стали 40х;
  • Червячное колесо изготовлено из углепластика УПА 6/30-2.
Рулевая колонка с электроусилителем руля

Это все характеристики компонента, которые необходимо знать для взаимодействия с ним.Эти показатели особенно актуальны, поскольку усилитель является электрическим агрегатом и с ним надо быть осторожным.

Электроруль имеет ряд преимуществ, что привело к тому, что его устанавливают не только на ВАЗ 2110, но и на другие модели этого завода. Помимо технических характеристик имеет и другие не менее важные показатели:

  • Простота монтажных работ при установке агрегата;
  • Устройство потребляет относительно небольшое количество электроэнергии;
  • Узел не влияет на экологические показатели автомобиля;
  • Возможен узел установки на другие модели ВАЗ;
  • Параметрические показатели, то есть эффективное снижение крутящего момента в соответствии с увеличением скорости автомобиля;
  • В процессе эксплуатации не требуется дополнительный уход и использование различных специальных материалов;
  • При низких температурных показателях данный вариант усиления руля работает лучше.

ТО Единственный недостаток этого устройства можно отнести к тому, что оно работает немного слабее, чем тот же гидроусилитель.

Новый электроусилитель руля ВАЗ 2110 с комплектующими

Но в случае с отечественными дорогами и этого прироста вполне достаточно, чтобы комфортно чувствовать себя за рулем.

Дело в том, что не все автомобили ВАЗ 2110 оснащены этим приятным компонентом, поэтому водителям часто приходится устанавливать усилитель самостоятельно. Эта работа не так сложна, как может показаться на первый взгляд, и при соблюдении определенных правил ее можно провести достаточно эффективно.

Кроме того, вы можете купить новый электроусилитель хоть через интернет и, немного повозившись в гараже, поставить его на свою десятку. Так как стоимость агрегата не такая уж и низкая, сэкономить на установке будет приятно и практично.

Для того, чтобы установить электроусилитель на автомобиль ВАЗ, необходимо предварительно подготовить некоторые инструменты и запчасти:

Табличка DIY Электропроводка
  • Рулевое колесо и крышка;
  • Отвертки различных конфигураций;
  • Линейка;
  • Дрель.

Никаких масел или других веществ не требуется, так как работа ведется с электричеством, а не с механическими агрегатами. После того, как все комплектующие подготовлены, следует приступить к непосредственному монтажу, который будет проходить в следующей последовательности:

  • Необходимо вытащить штатную клемму из колодки и переместить ее в колодку, расположенную на жгуте;
  • После этого свободная клемма, отходящая от жгута, перемещается на место, где располагался штатный провод, примыкающий к колодке.Это позволит пропустить между жгутами провод стандартного типа. Провод, идущий от блоков, имеет номинал 50 А;
  • Теперь нужно медленно отделить кожух рулевого вала, затем снять замок зажигания и разъединить переключатели. Делать это нужно медленно, чтобы предотвратить растрескивание корпуса;
  • Аккуратно откручиваем болт который держит рулевую рейку и далее снимается непосредственно рейка;
Открутить болт на рейке
  • Необходимо измерить длину валов и если нужно подогнать пластину, то для этого нужно воспользоваться линейкой и возможно даже записать показатели;
  • На освободившееся место устанавливается электроусилитель, для этого необходимо подобрать вал нужного размера, так как он не подходит к рейке. Чтобы подогнать вал под необходимый размер, пластину и вал перетачивают под валы Приора. Именно запчасти от ВАЗ «Приора» подходят для этого как нельзя лучше;
  • После установки вала необходимо просверлить пластину глубже, чем она есть. Сделать это несложно, так как вал представляет собой полую конструкцию;
Пересверленная самодельная пластина
  • Пластина устанавливается на усилитель и таким образом проверяется полученная глубина. Если все нормально, то нужно крепко зажать всю конструкцию болтом поменьше;
Установка пластины
  • Теперь необходимо установить выключатели на свои места и приступить к проводке.Для этого из салона через левое крыло подведите два провода прямо к аккумулятору;
  • Далее нужно снять бачок омывателя и взять провод. С его помощью необходимо присоединить выведенные два провода. Их нужно прикрепить к концу противоположной проволоки и протянуть оба;
  • Нужно снять приборную панель и вынуть оттуда красную колодку, медленно затянуть проводку в пространство под панелью. Затем достаньте провод оранжевого цвета из красной коробки;
  • Красная коробка должна быть закреплена на этом проводе и совмещена с проводкой электроусилителя.При этом конец с оголенным выводом проводки усилителя кладется на освободившийся штатный провод в красной колодке;
  • Также нужно поступить с серым проводом, который тоже выходит из красного блока. Его также необходимо втянуть на место штатного аналога и закрепить клеммой;
  • Затем нужно перейти к аккумулятору и надежно прикрутить черный провод, то есть МИНУС, к розовому проводу, то есть к ПЛЮСУ;
  • После этого нужно подключить всю проводку электроусилителя руля и запустить его или просто покрутить руками.

Установка электроусилителя завершена, осталось только аккуратно установить все комплектующие на свои места.

Для этого нужно переустановить все переключатели и подогнать кожух и руль, который будет закрывать рулевой вал.

Если работы по установке электроусилителя проводит опытный мастер, который может несколько выходить за рамки предложенной инструкции, то следует сказать о том, как устанавливается электроусилитель на ВАЗ 2110.

После выполнения основных действий из приведенного выше списка можно произвести следующую настройку:

  • Выровнять руль;
  • Устранить все зазоры и зазоры между деталями;
  • Установить светодиодный датчик диагностики электроусилителя;
  • Слегка укоротить кабель питания;
  • При необходимости замените поврежденные детали и поврежденные детали корпуса.

После этого следует еще раз внимательно осмотреть рулевую систему, сидя в салоне.Устранить последние огрехи и натереть полиролью панель и руль. Только после этого можно переходить к дальнейшей эксплуатации авто. Именно соблюдение чистоты и порядка в салоне автомобиля приводит к концентрации водителя за рулем.

Ремонт электроусилителя руля производителем АвтоВАЗ не предусмотрен, только полная замена в сборе. Поэтому все действия по ремонту проводит владелец автомобиля на свой страх и риск.

Всегда нужно помнить, что ремонт электроусилителя руля своими руками ВАЗ 2110 может привести к аварии!

Цена на электроусилитель руля ВАЗ 2110 и комплектующие следующая:

  • новый электроусилитель стоит в среднем от 13 000 до 18 000 рублей, заказать можно в интернет-магазинах с доставкой почтой в любой регион России, либо напрямую с завода;
  • Электроусилитель б/у стоит от 2000 до 6000 рублей в зависимости от состояния, стоит посмотреть на местных досках объявлений, авито. ру и др.

Компоненты для установки также могут продаваться отдельно:

  • рулевой вал для установки электроусилителя руля — цена около 1000 руб.;
  • кронштейн для установки электроусилителя руля — цена около 1000 рублей;
  • жгут проводов для подключения ЭУР — стоимость около 1500 руб.;
  • имитация электронного датчика скорости (для карбюраторных двигателей) — около 1500 руб.

Из приведенной информации становится понятно, что ЭУР на ВАЗ 2110 имеет массу положительных показателей, что и сделало его популярным.В процессе эксплуатации этот компонент не требует никакого вмешательства и дополнительных материалов.

Электроусилитель руля не требует обслуживания и регулировки. Он прекрасно показывает себя в морозных российских условиях и его работа в связи с этим никак не меняется.

Нет необходимости предварительно прогревать автомобиль перед поездкой, а значит, водитель быстрее отправится в путь.

Но наряду с этим у устройства есть и недостатки, хотя в случае с ВАЗ 2110 это не бросается в глаза. Каждый водитель имеет возможность самостоятельно решить, какой усилитель ему больше подходит, тем более, что электроусилитель можно установить самостоятельно.

Если есть желание сделать вождение ВАЗ 2110 безопасным и комфортным, то стоит отдать предпочтение электроусилителю.

Black Fret приедет в Сиэтл в следующем году, обещая новый способ поддержки артистов

KEXP Sound & Vision выходит в эфир каждую субботу утром с 7 до 9 утра по тихоокеанскому времени и включает интервью, художественные выступления, комментарии, идеи и разговоры, которые рассказывают более широкие истории через музыку и иллюстрируют, почему музыка и искусство имеют значение.Вы также можете услышать больше историй в новом подкасте Sound & Vision. Новые серии выходят каждый вторник. Подпишись сейчас.


Black Fret приедет в Сиэтл в январе 2020 года. Услуга основана на членстве: люди платят ежегодный взнос за интимные живые выступления, а в конце года деньги от этих членских взносов передаются музыкантам. В прошлом году Black Fret выделил гранты в размере 20 000 долларов США 10 музыкантам и меньшие гранты в размере 5 000 долларов США еще 10 музыкантам в родном городе некоммерческой организации Остин, штат Техас.Ведущая Sound & Vision Эмили Фокс поговорила с исполнительным директором Black Fret Seattle Беном Лондоном об услуге и о том, почему она расширяется в Сиэтле.

Об идее Black Fret:

Предпосылка заключалась в том, что [Black Fret] считал, что местная музыка должна поддерживаться так же, как исторически поддерживалась опера, симфония и балет. Итак, они создали эту организацию, которая создавала опыт, опыт живой музыки для доноров, которые затем, в свою очередь, объединялись в форме грантов для музыкантов для поддержки таких вещей, как запись, гастроли или своего рода профессиональное развитие, которое атрофируется в текущий музыкальный ландшафт.


О доставке Black Fret в Сиэтл:

Музыка – неотъемлемая часть культуры нашего города. Но в то же время наш город переживает беспрецедентный рост. Есть экономические факторы, которые мешают музыкантам выживать. И когда стоимость жизни достигает паритета с такими местами, как Лос-Анджелес или Сан-Франциско, мы видим, что все больше наших музыкантов направляются в эти места, потому что существует восприятие или реальность, что у них больше возможностей.И лично я не хочу жить в городе, где музыка не играет большой роли.


О финансовой ценности такой услуги, как Black Fret, в современной музыкальной индустрии:

Я вижу молодых музыкантов или музыкантов в целом – проблемы, с которыми они сталкиваются в мире. Что-то вроде тройной угрозы роста стоимости жизни, демократизации записанной музыки, когда доход от потоковой передачи не был достигнут, и изменений в концертном бизнесе, когда местные артисты на самом деле не отправляются в национальные туры, как когда-то в поддержку выступлений. .Итак, как можно построить карьеру, когда все, что ты делаешь, это вкладываешь деньги, а денег на самом деле не так уж много?


О том, как выглядит успех Black Fret:

Я думаю, что Black Fret может добиться успеха, если мы сможем привлечь все сообщество, чтобы собраться вместе и понять, что мы не можем ждать, пока идеальное решение упадет с неба, что, если мы все немного вложимся, мы сможем гарантировать, что это продолжает оставаться жизненно важным регионом для музыки, искусства и культуры, и мы обязаны жить здесь. Мы платим налоги за улицы. Мы платим налоги за пожарных и полицию. Это не налог. Но если мы будем поддерживать наше искусство и культуру, то это повысит качество нашей жизни.


 

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

%PDF-1.4 % 197 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 197 135 0000000016 00000 н 0000003052 00000 н 0000003286 00000 н 0000003317 00000 н 0000003385 00000 н 0000004101 00000 н 0000004863 00000 н 0000004930 00000 н 0000005183 00000 н 0000005291 00000 н 0000005396 00000 н 0000005521 00000 н 0000005641 00000 н 0000005757 00000 н 0000005927 00000 н 0000006026 00000 н 0000006137 00000 н 0000006307 00000 н 0000006432 00000 н 0000006553 00000 н 0000006696 00000 н 0000006840 00000 н 0000006981 00000 н 0000007125 00000 н 0000007267 00000 н 0000007409 00000 н 0000007553 00000 н 0000007694 00000 н 0000007837 00000 н 0000007977 00000 н 0000008123 00000 н 0000008265 00000 н 0000008406 00000 н 0000008548 00000 н 0000008692 00000 н 0000008832 00000 н 0000008972 00000 н 0000009112 00000 н 0000009253 00000 н 0000009395 00000 н 0000009534 00000 н 0000009675 00000 н 0000009814 00000 н 0000009958 00000 н 0000010101 00000 н 0000010246 00000 н 0000010387 00000 н 0000010532 00000 н 0000010673 00000 н 0000010819 00000 н 0000010964 00000 н 0000011106 00000 н 0000011248 00000 н 0000011393 00000 н 0000011538 00000 н 0000011683 00000 н 0000011828 00000 н 0000012004 00000 н 0000012147 00000 н 0000012291 00000 н 0000012434 00000 н 0000012578 00000 н 0000012725 00000 н 0000012868 00000 н 0000013015 00000 н 0000013160 00000 н 0000013303 00000 н 0000013444 00000 н 0000013587 00000 н 0000013729 00000 н 0000013871 00000 н 0000014014 00000 н 0000014159 00000 н 0000014304 00000 н 0000014448 00000 н 0000014594 00000 н 0000014742 00000 н 0000014888 00000 н 0000015073 00000 н 0000015169 00000 н 0000015266 00000 н 0000015362 00000 н 0000015459 00000 н 0000015552 00000 н 0000015646 00000 н 0000015741 00000 н 0000015837 00000 н 0000015932 00000 н 0000016028 00000 н 0000016123 00000 н 0000016219 00000 н 0000016313 00000 н 0000016408 00000 н 0000016504 00000 н 0000016709 00000 н 0000016909 00000 н 0000017579 00000 н 0000018172 00000 н 0000018194 00000 н 0000019118 00000 н 0000019227 00000 н 0000019486 00000 н 0000020540 00000 н 0000020854 00000 н 0000021520 00000 н 0000021542 00000 н 0000022350 00000 н 0000022697 00000 н 0000023463 00000 н 0000023911 00000 н 0000024302 00000 н 0000030055 00000 н 0000030077 00000 н 0000030880 00000 н 0000031213 00000 н 0000031582 00000 н 0000034578 00000 н 0000035070 00000 н 0000035271 00000 н 0000035293 00000 н 0000036071 00000 н 0000036093 00000 н 0000036849 00000 н 0000036871 00000 н 0000037682 00000 н 0000037704 00000 н 0000038449 00000 н 0000038471 00000 н 0000039100 00000 н 0000047064 00000 н 0000047158 00000 н 0000053829 00000 н 0000073163 00000 н 0000003426 00000 н 0000004079 00000 н трейлер ] >> startxref 0 %%EOF 198 0 объект > эндообъект 199 0 объект [ 200 0 р ] эндообъект 200 0 объект > >> эндообъект 201 0 объект > эндообъект 330 0 объект > ручей HKhAmZ U*»&ZI v7yRJwI!BŃs*=ǽq FA%’QO&E?^73

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Структурные изменения в цитоплазматической поре канала Kir1.1 при рНi-гейтинге, зондированном методом FRET | Journal of Biomedical Science

Слияние каналов с флуоресцентными белками

кДНК для Kir 1.1 и Kir2.1, а также мутант, слитый с ECFP/EYFP, конструировали с использованием коммерчески доступных векторов pCMV-ECFP/EYFP (Clontech, Palo Alto, CA). Линкер GGGGGG использовали для слияния EYFP с С-концом каналов Kir1.1 и Kir2.1.

Культура клеток

Клетки HEK293T культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies, Пейсли, Шотландия) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37°С. C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO 2 .Клетки высевали на покрытые поли-L-лизином покровные стекла № 1 (42 мм) (Carl Zeiss, Inc., Германия) и временно трансфицировали 2 мкг плазмид с использованием LipofectAMINE 2000 (Invitrogen Co., Карлсбад, Калифорния, США). ) и использовали через 1-2 дня после трансфекции.

Получение ооцитов Xenopus

Ооциты Xenopus выделяли путем частичной овариэктомии у лягушек, подвергнутых анестезии 0,1% трикаином (этиловым эфиром 3-аминобензойной кислоты). кДНК слитых каналов субклонировали в вектор экспрессии pGEMHE, и кРНК получали путем транскрипции in vitro (mMessage mMachine, Ambion, Даллас, США).Ооциты использовали через 1–3 дня после инъекции кРНК или кДНК.

Подготовка листов изолированной плазматической мембраны клеток HEK293T

Листы изолированной плазматической мембраны, прикрепленные к покровному стеклу, готовили путем обработки ультразвуком в фосфатно-солевом буфере (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4 и 2 мМ KH 2 PO 4 , pH 7,4) при 0°C и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут перед экспериментами.

Электрофизиологические записи

Макроскопические токи регистрировали при комнатной температуре (21–24°C) с использованием методики patch-clamp [8, 9] и усилителя Axopatch 200B (Axon Instruments, Foster City, CA, USA).Внутренний (pH 6-10) и внешний (pH 7,4) 100 мМ [K + ] раствор содержал 80 мМ (KCl + KOH), 5 мМ ЭДТА и 5 мМ HEPES. Импульсы командного напряжения контролировались, а данные собирались с помощью программного обеспечения pClamp6 (Axon Instruments, Фостер-Сити, Калифорния, США).

Измерение FRET

Флуоресценцию получали с использованием микроскопа Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Inc., Германия), оснащенного ртутной лампой и следующими кубами фильтров (нм): (1) куб CFP: EX 436/20, EM 480/40, ДЦЛП 455; (2) куб EYFP: EX 500/20, EM 535/30, DCLP 515; (3) Куб FRET: EX 436/20, EM 535/30, DCLP 455 (Omega Optical, Brattleboro, VT, США).Отношение FRET (FR) определяли с использованием 3-кубового подхода [10]. FR равен частичному увеличению эмиссии EYFP из-за FRET и рассчитывается как: )] MathType @ СПР @ 5 @ 5 + = feaagaart1ev2aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi = xI8qiVKYPFjYdHaVhbbf9v8qqaqFr0xc9vqFj0dXdbba91qpepeI8k8fiI + FSY = rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr = XFR = ee4qamKaeeO[email protected][email protected]

(1)

В уравнении [1] и определениях R D1 , R D2 и R A1 , приведенных ниже, S FRET , S ECFP и S ECFP и S E0FP, за которыми следует D , или DA в скобках указывают интенсивность флуоресценции с использованием указанного куба фильтра и клеток, экспрессирующих только донор, ECFP (D), только акцептор, EYFP (A) или оба (DA).R D1 , что равно S FRET (D)/S ECFP (D), R D2 , что равно S EYFP (D)/S ECFP (D), и R A1 , который равен S FRET (A)/S EYFP (A), являются предопределенными константами из измерений, примененных к отдельным клеткам, экспрессирующим только ECFP- или EYFP-меченый Kir2.1. R D1 , R D2 и R A1 были определены как 0,51 ± 0,01 (n = 9), 0,0053 ± 0,0001 (n = 9) и 0.26 ± 0,001 (n = 6) соответственно. Эффективная эффективность FRET (E EFF ) определяется как

E EFF = (FR — 1)[ε YFP (440)/ε CFP (440)] (2)

Член в квадратных скобках представляет собой отношение молярных коэффициентов экстинкции YFP и CFP, масштабированное для кубического фильтра возбуждения FRET [10], и ранее было определено равным 0,094 [10].

Подтверждение с помощью FRET в отдельных живых клетках отсутствия значимой амилоидной β-опосредованной активации каспазы 8

Реферат

Когда клетки подвергаются воздействию вызывающих гибель молекул, таких как фактор некроза опухоли-α или Fas, каспаза 8 активируется и расщепляет апоптотический посредник Bid, который является членом семейства Bcl-2.После дополнительной модификации С-концевая часть Bid перемещается в митохондрии и индуцирует высвобождение цитохрома c в цитоплазму. Пытаясь непосредственно наблюдать расщепление Bid и последующие события в живых клетках, мы сконструировали вектор, кодирующий Bid, слитый с желтым флуоресцентным белком (YFP) и голубым флуоресцентным белком (CFP) (YFP-Bid-CFP). При экспрессии YFP-Bid-CFP в клетках млекопитающих мы смогли наблюдать эффективную передачу энергии от возбужденного CFP к YFP внутри молекулы YFP-Bid-CFP, и, что важно, слитый белок YFP-Bid-CFP был полностью функциональным. в клетках.Когда YFP-Bid-CFP расщеплялся каспазой 8 при активации анти-Fas Abs, но не Aβ или туникамицином, такой перенос энергии не обнаруживался. Насколько нам известно, это первый отчет ( i ) о визуализации активации Bid путем протеолитического расщепления с прямым наблюдением за расщеплением YFP-Bid-CFP в цитоплазме и последующей транслокацией расщепленного Bid в митохондрии и ( ii ) отсутствие опосредованной Aβ или туникамицином значительной активации каспазы 8 в отдельных живых клетках.

Апоптоз играет важную роль в развитии и гомеостазе, и было показано, что каспазы играют важную роль в апоптозе. Сложные фенотипы мышей с нокаутом каспаз позволяют предположить, что множественные механизмы активации каспаз действуют параллельно и что пути передачи сигнала к апоптозу являются стимул-специфичными и специфичными для отдельных типов клеток (1).

Повреждение митохондрий является основным этапом усиления сигнала в пути апоптоза, и митохондрии также являются основным местом действия белков семейства Bcl-2 (2).Многие члены этого семейства содержат четыре консервативных домена (2), обозначенных как Bh2, Bh3, Bh4 и Bh5 (BH, B cl-2 h омологический домен), и хотя многие из этих белков являются проапоптотическими [Bax, Bak и др. (3, 4)], другие являются антиапоптотическими [Bcl-2, Bcl-x L и др. (5, 6)]. Независимо от их про- или антиапоптотических эффекторов, многие из этих белков имеют склонность к образованию гомо- и гетеродимеров.

Bid является проапоптотическим членом семейства Bcl-2, который содержит только домен Bh4.Впервые была отмечена его способность связываться с Bcl-2 и Bax (3). Мутационный анализ показал, что интактный домен Bh4 необходим для связывания с Bcl-2 и Bax, и эта связывающая активность коррелирует со способностью Bid вызывать гибель клеток. Эти наблюдения позволили предположить модель, в которой Bid служит лигандом, вызывающим гибель, который перемещается из цитозоля в митохондриальную мембрану, чтобы инактивировать Bcl-2 или активировать Bax (3, 7). В пролиферирующих клетках неактивный Bid (белок 22 кДа, p22) локализуется в цитоплазме.При воздействии на клетки фактора некроза опухоли-α или Fas, оба из которых индуцируют апоптоз, каспаза 8 активируется вызывающим гибель сигнальным комплексом. Расщепление Bid каспазой 8 дает два фрагмента (p15 и p7) (8). Открытый остаток глицина на С-конце Bid (p15) подвергается миристоилированию N- (9), и полученный C-концевой фрагмент Bid (p15) перемещается на наружную мембрану митохондрий, где он связывается с Bax или с Бак (4, 10). Эти взаимодействия индуцируют высвобождение цитохрома с из митохондрий, а высвобождение цитохрома с приводит к образованию в цитоплазме комплекса, содержащего цитохром с , Apaf1 и каспазу 9.Этот комплекс активирует каспазу 9, а активная каспаза 9 расщепляет нижележащие эффекторы каспазы 3 и каспазы 7 (11).

В предыдущем исследовании (9) GFP был слит с С-концом Bid и выявил транслокацию Bid-GFP в митохондрии из цитозоля. Однако эта система не могла непосредственно наблюдать расщепление Bid и, таким образом, давала ограниченную информацию для мониторинга активации каспазы 8 в дополнение к транслокации Bid в отдельных живых клетках.

Недавно было продемонстрировано, что можно слить два белка, которые флуоресцируют на разных длинах волн, и отслеживать резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) (12–14) и обнаруживать протеолитическую активность (15), точно так же, как обнаружение внутриклеточное расщепление нуклеиновых кислот методом FRET (16).Первым успешным примером этой стратегии было генетическое конструирование тандемных молекул Blue Fluorescent Protein-GFP, соединенных линкерной последовательностью, которая могла быть расщеплена определенной протеазой (17). FRET произошел, когда два белка, которые флуоресцируют на разных длинах волн (донорный и акцепторный), были связаны вместе, и энергия могла передаваться непосредственно от донора к акцептору. При разделении акцептора и донора протеолитическим расщеплением линкера FRET не регистрировалось.Таким образом, FRET является мощным инструментом для исследования молекулярных событий в живых клетках (12–19).

В нашей недавней работе Bid был идентифицирован как один из проапоптотических генов с помощью нашей системы обнаружения функциональных генов, основанной на рандомизированных библиотеках гибридных рибозимов (20–22). Чтобы непосредственно наблюдать за активацией идентифицированного Bid различными индукторами апоптоза и обнаруживать активность каспазы 8 в апоптотических клетках, мы сконструировали гибридный белок, соединив желтый флуоресцентный белок (YFP) и голубой флуоресцентный белок (CFP) с N-концом и C-концом. окончания торгов соответственно.Используя нашу систему, мы получили in vivo изображений активации каспазы 8 в одной клетке, что позволило нам продемонстрировать отсутствие значимой активации каспазы 8, опосредованной амилоид-β-пептидом (Aβ) или туникамицином (Tm) в отдельных клетках. живые клетки.

Материалы и методы

Клонирование кДНК для Bid и конструирование вектора экспрессии для YFP-Bid-CFP.

Ген усиленного YFP (CLONTECH) амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в сайты Bam HI и Hin dIII pcDNA 3 (Invitrogen) для получения pYFP.Ген усиленного CFP (CLONTECH) также амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в сайт Xho I pYFP для получения pFRET. Вектор pFRET-линкер (кодирующий YFP-линкер-CFP) кодировал три дополнительных остатка глицина в сайте Bam HI/ Eco RI pFRET.

Полноразмерный ген для Bid был амплифицирован из библиотеки кДНК печени человека в плазмиде (Takara, Kyoto) с верхним cBid (5′-CAGGCCATGGACTGTGAGGTCAACA-3′) и нижним cBid (5′-TCAGTCCATCCCATTTCTGGCTAAG-3′) в качестве праймеров.Продукт ПЦР клонировали в pGEM-T (Promega), и целостность клонированной кДНК подтверждали секвенированием. Укороченную форму Bid амплифицировали с BidFRET-F (5′-CGGGATCCGAGTGCATCACAAA-3′) и BidFRET-R (5′-GCGAATTCATTTCTGGCTAAGC-3′) в качестве праймеров из клонированного Bid в pGEM-T. Продукт ПЦР расщепляли Bam HI и Eco RI и субклонировали в сайте pFRET Bam HI/ Eco RI для получения pFRET-Bid. Укороченную форму Bid встраивали в вектор pYFP с использованием тех же рестрикционных ферментов.Короткая форма Bid с добавлением метионина была амплифицирована с помощью Hind-Met-fBid-5′ (5′-AAGCTTATGGAGTGCATCACAAACCTACT-3′), поскольку укороченная форма Bid не имела стартового кодона, и BidFRET-r в качестве праймеров из клонированных Ставка в pGEM-T. Продукт ПЦР Bid встраивали в сайт pFRET Hin dIII/ Eco RI для получения pBid-CFP.

Культура и трансфекция клеток.

клеток COS7 и клеток NIH 3T3 выращивали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% FCS (GIBCO/BRL).Перед трансфекцией клетки делили на аликвоты по 1 ? Через 16–24 ч клетки трансфицировали pFRET-Bid с использованием реагента для трансфекции PolyFect (Qiagen, Chatsworth, CA) в соответствии с протоколом производителя. Клетки SK-N-SH выращивали в MEM-α (GIBCO/BRL) с добавлением 10% FCS (GIBCO/BRL). Клетки SK-N-SH стабильно трансфицировали плазмидами с использованием липофектамина 2000 (GIBCO/BRL) в соответствии с протоколом производителя.После трансфекции клетки отбирали путем обработки генетицином (Sigma) и клонировали стабильные клеточные линии.

Получение флуоресцентных изображений каждой клеточной линии.

Перед обработкой клеток лекарственными препаратами клетки, временно или стабильно экспрессирующие слитые белки, культивировали на чашке со стеклянным дном (IWAKI, Токио) в течение 40 или 24 часов соответственно. Клетки наблюдали с помощью обычной флуоресцентной микроскопии Olympus IX-50. Чтобы наблюдать эффект FRET in vivo, клетки возбуждали с помощью фильтра возбуждения (440 ± 10 нм) и дихроичного зеркала 455 нм.Эмиссионные изображения YFP (545 ± 17,5 нм) и CFP (480 ± 15 нм) регистрировали с помощью управляемой компьютером охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (ARGAS-20, Hamamatsu Photonics). Цифровые флуоресцентные изображения затем обрабатывали с помощью программного обеспечения nih image. Контраст был изменен на изображении в градациях серого в том же диапазоне. Затем эти изображения были раскрашены с помощью программного обеспечения Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Изображения были вычтены из фона. При сравнении изображений растяжение контраста и цветовая шкала были одинаковыми, так что сравнимая яркость на каждом изображении соответствовала сравнимому сигналу над фоном.

Расщепление YFP-Bid-CFP рекомбинантной каспазой 8

in Vitro .

клетки COS7, трансфицированные pFRET-Bid, собирали и ресуспендировали в буфере для обработки ультразвуком, который содержал 20 мМ Hepes (pH 7,5), 10 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2 , 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA и 1 мМ DTT при 4 °С. После обработки ультразвуком гомогенат центрифугировали при 10 000 × g в течение 10 мин, а супернатант использовали для анализа расщепления рекомбинантной каспазой 8 человека (Oncogene Science) при 25°C.

Оптические измерения.

После инкубации с каспазой 8 реакционные смеси (общий объем 600 мкл) переносили в кювету спектрофлуориметра (FP-750, Jasco, Токио). Спектры испускания флуоресценции регистрировали после возбуждения при 433 нм. Экстракты родительских клеток использовали в качестве контроля.

Иммуноблоттинг.

Экстракты клеток, которые инкубировали с каспазой 8, разделяли с помощью SDS/PAGE (10% полиакриламид), а затем белки переносили на мембрану Clear Blot Membrane-P (ATTO, Токио) с помощью электропереноса.Блоты исследовали поликлональными антителами против GFP, а затем вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Amersham Pharmacia). Иммунореакции выявляли с помощью системы вестерн-блоттинга ECL Plus (Amersham Pharmacia).

Индукция апоптоза и визуализация живых клеток.

клеток NIH 3T3, трансфицированных pFRET-Bid, выращивали в чашках со стеклянным дном диаметром 35 мм в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали фактором некроза опухоли-α (0.5 нг/мл; Sigma) и циклогексимид (1 мкг/мл; Sigma) (23) и исследовали через 3 часа с помощью флуоресцентной микроскопии. Митохондрии идентифицировали с помощью 100 нМ MitoTracker (Molecular Probes).

Линии клеток SK-N-SH, стабильно трансфицированные pFRET-линкером или pFRET-Bid, обрабатывали анти-Fas Ab (1 мкг/мл; Medical and Biological Laboratories, Нагоя, Япония) и циклогексимидом (1 мкг/мл). мл; Sigma; ссылка 24), Tm (2 мкг/мл; Sigma; ссылки 25 и 26) или Aβ (25–35 а.к.; 40 мкМ; Biochem; ссылки.27–29). Клетки, обработанные антителом против Fas, исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии через 6 часов, а другие обработанные клетки исследовали после 12-часовой инкубации.

Результаты и обсуждение

Разработка идентифицированной заявки с помощью системы открытия генов для обеспечения сенсорных функций.

Чтобы непосредственно наблюдать за активацией Bid, который ранее был идентифицирован как один из проапоптотических генов, с помощью наших рандомизированных библиотек гибридных рибозимов (20–22), мы соединили YFP и CFP с N- и C-концами Bid, соответственно, через спейсер, содержащий в каждом случае по три глициновых остатка (рис.1). В случае YFP ​​и CFP максимальное расстояние, на котором может происходить резонансная передача энергии, ограничено 100 Å, и, кроме того, эффективность передачи энергии чрезвычайно чувствительна к расстоянию между донором (CFP) и акцептором (YFP). Чтобы расположить донор на приемлемом расстоянии от акцептора, мы удалили аминокислоты с обоих концов Bid (рис. 1 A ), согласно информации из кристаллической структуры Bid (30, 31), надеясь, что полученный химерный белок будет функциональным in vivo .Полученный слитый белок YFP-Bid-CFP позволял осуществлять прямую передачу резонансной энергии от CFP к YFP (рис. 1 D ). Химерный белок сохранил последовательность, расщепляемую каспазой 8, и сайт миристоилирования (9). Мы ожидали, что когда химерный Bid будет расщеплен каспазой 8, FRET больше не будет происходить.

Рис. 1.

( A ) Схематическое изображение доменной структуры CFP-Bid-YFP. YFP и CFP были соединены с Bid (остатки 16–194) гибкими спейсерами, каждый из которых состоял из трех остатков глицина, с образованием CFP-Bid-YFP.Стрелка между остатками 61 и 62 указывает на сайт расщепления каспазой 8. ( B ) В нашей системе FRET возбуждение CFP при 433 нм должно приводить к эмиссии при 473 нм, если в непосредственной близости нет YFP. В YFP-Bid-CFP энергия должна передаваться от возбужденного CFP к YFP с результирующим излучением на длине волны 525 нм. Когда слитый белок расщепляется каспазой 8, энергия больше не может передаваться от возбужденного CFP к YFP. ( C ) Флуоресцентные изображения клеток COS7, экспрессирующих указанные слитые белки (ось у ).Изображения были получены с использованием фильтров FRET, CFP и YFP (ось x ). (Bar = 20 мкм.) ( D ) Спектры флуоресценции экстрактов клеток, экспрессирующих различные слитые белки. Количество общего белка для каждого образца доводили до 1,4 мг/мл. Экстракты клеток, экспрессирующих YFP-Bid (розовая линия), Bid-CFP (черная линия), YFP-Bid-CFP (зеленая линия), YFP-линкер-CFP (желтая линия) и родительские клетки (красная линия), были возбуждены. при 433 нм, а спектры испускания регистрировали и нормализовали при 450 нм.

Мы попытались визуализировать изменения FRET непосредственно с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. Когда клетки COS7, которые экспрессировали YFP-Bid, возбуждались синим светом (460–490 нм) и отслеживалась эмиссия в зеленом диапазоне (510–550 нм), сигналы легко обнаруживались (рис. 1 C Top Center ). Эти клетки не излучали флуоресценции при возбуждении при 400–440 нм (рис. 1 C, вверху слева и справа ). При возбуждении клеток COS7, экспрессирующих Bid-CFP, при длине волны 400–440 нм испускаемую флуоресценцию можно было наблюдать в синем диапазоне (рис.1 C Средний левый ). В этом случае значительного FRET не наблюдалось (рис. 1 C, средний правый ), а синий свет 460–490 нм не мог возбудить белок Bid-CFP (рис. 1 C, средний центр ). Напротив, когда клетки, которые экспрессировали YFP-Bid-CFP, возбуждались при 460–490 нм или при 400–440 нм, мы обнаруживали флуоресценцию из-за YFP, CFP и FRET (рис. 1 C, внизу ). Следует отметить, что во всех экспериментах по визуализации, в том числе и на рис. 4 и 5, как для реального, так и для контрольного FRET-изображений использовались одни и те же экспозиции.

На рис. 1 D показан спектр флуоресценции экстрактов из каждой клеточной линии при возбуждении во флуорометре при 433 нм. Лизаты клеток, которые экспрессировали YFP-Bid-CFP и YFP-линкер-CFP (описаны в Materials and Methods ), давали пик при 525 нм, который соответствовал FRET. Напротив, лизаты клеток, которые экспрессировали YFP-Bid, не давали аналогичного пика при 525 нм, а в спектрах излучения Bid-CFP наблюдался пик при 473 нм. Лизаты родительских клеток не показывали пика при возбуждении при 433 нм.Эти наблюдения указывали на эффективную передачу энергии между донором (CFP) и акцептором (YFP) внутри слитого белка.

Подтверждение того, что сконструированный YFP-Bid-CFP действует в качестве субстрата для Caspase 8

in Vitro .

Мы исследовали, может ли химерный белок YFP-Bid-CFP по-прежнему служить субстратом для каспазы 8 in vitro , а также быть полностью функциональным in vivo , потому что для обеспечения FRET мы укорочили Bid на обоих концах.Мы записали эмиссионные спектры экстракта клеток COS7, экспрессирующих YFP-Bid-CFP, до и после инкубации аликвот клеточного экстракта с возрастающими количествами каспазы 8 в течение 1–22 ч (рис. 2). Эффективность FRET явно зависела от количества каспазы 8 (рис. 2 A ) и продолжительности инкубации (рис. 2 C ). Флуоресценция из-за FRET (пик при 525 нм) неуклонно снижалась с увеличением концентрации каспазы 8 и достигала минимума при 1000 единиц (рис.2 A , голубая линия).

Рис. 2.

( A ) Результаты спектрофлуориметрического анализа расщепления YFP-Bid-CFP в клеточных экстрактах каспазой 8. Экстракты инкубировали с возрастающими количествами каспазы 8 (Cas-8) в течение 22 ч при 25°C, а затем спектры регистрировали после возбуждения при 433 нм. ( B ) Отношение флуоресценции YFP (525 нм) к флуоресценции CFP (473 нм) рассчитывали для каждой концентрации каспазы 8 в реакционной смеси. Относительное отношение FRET определяли как отношение значений флуоресценции YFP/флуоресценции CFP, измеренных до и после инкубации с каспазой 8.( C ) Зависимое от времени расщепление YFP-Bid-CFP, как показано спектрофлуориметрическим анализом.

Чтобы определить чувствительность слитого белка к каспазе 8, мы перестроили данные, показанные на рис. 2 A , как показано на рис. 2 B , на котором относительное отношение флуоресценции YFP к флуоресценции CFP ( измеренный при 525 и 473 нм соответственно) построен в зависимости от концентрации каспазы 8 в логарифмической шкале. Соотношение (YFP/CFP) нормализовали относительно отношения нерасщепленного слитого белка.Мы также подтвердили, что слитый белок был расщеплен каспазой 8 с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3). После 13-часовой инкубации уровень YFP-Bid-CFP в контрольной дорожке (нагруженной клеточным лизатом без добавления каспазы 8; дорожка 1) не изменился. Напротив, когда клеточный лизат инкубировали с 1000 единиц каспазы 8 (дорожка 2), YFP-Bid-CFP расщеплялся на два фрагмента с ожидаемой подвижностью. Эти результаты показали, что слитый белок распознается как субстрат и расщепляется каспазой 8 in vitro и что FRET очень чувствителен к активности каспазы 8.Таким образом, YFP-Bid-CFP является хорошим индикатором расщепления Bid, предположительно из-за активации каспазы 8 in vivo . Поэтому в этом отчете мы утверждаем, что индикатор является показателем активации каспазы.

Рис. 3.

Вестерн-блоттинг, демонстрирующий расщепление YFP-Bid-CFP каспазой 8. Дорожка 1, контроль (без каспазы 8) и дорожка 2, экстракт клеток COS 7, инкубированных с 1000 единиц каспазы 8 в течение 22 ч при 25°C . Экстракты разделяли с помощью SDS/PAGE на 10% полиакриламидном геле и подвергали вестерн-блоттингу с анти-GFP Ab.Верхняя стрелка указывает YFP-Bid-CFP. Средняя стрелка указывает на белок, слитый с С-концом Bid-CFP, а нижняя стрелка указывает на белок, слитый с YFP-N-концом Bid.

Мониторинг активности каспазы 8 с помощью YFP-Bid-CFP в отдельной клетке.

Затем мы проверили, позволит ли слитый белок контролировать активность каспазы 8 в отдельных клетках. Мы трансфицировали клетки NIH 3T3 плазмидой, кодирующей YFP-Bid-CFP, и индуцировали апоптоз, подвергая клетки воздействию фактора некроза опухоли-α и циклогексимида.Эти агенты нарушают потенциал митохондриальной мембраны в клетках NIH 3T3 (23). Как показано на рис. 4, YFP-Bid-CFP дает диффузные флуоресцентные изображения, когда CFP и YFP возбуждаются (рис. 4 B и C ) в необработанных клетках. Напротив, при индукции гибели клеток (рис. 4 D G ) флуоресцировал только CFP (рис. 4 E и F ), а флуоресценция была локализована в митохондриях (рис. 4 G ). ). Эти результаты показали, что, несмотря на модификации на обоих концах, YFP-Bid-CFP был полностью функциональным in vivo и действовал как сенсор активированной каспазы 8.

Рис. 4.

Субклеточная локализация YFP-Bid-CFP. Клетки NIH 3T3 трансфицировали pFRET-Bid и инкубировали в течение 52 часов. Клетки D G подвергали воздействию фактора некроза опухоли-α плюс циклогексимид в течение 3 часов. Контрольная группа не подвергалась воздействию этих агентов ( A C ). После инкубации клетки исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Фазово-контрастные изображения ( A и D ), изображения флуоресценции CFP ( B и E ) и изображения флуоресценции YFP ( C и F ).(Bar = 20 мкм в A F .) Субклеточную локализацию укороченных Bid (голубая флуоресценция) и митохондрий (оранжевая флуоресценция) оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии ( G ). (Пруток = 10 мкм.)

Роль Aβ в развитии болезни Альцгеймера.

Используя слитый белок с донорной и акцепторной частями, мы исследовали другие системы клеточной гибели, сосредоточив внимание на этиологии болезни Альцгеймера, нейродегенеративного расстройства, характеризующегося нейритными бляшками и нейрофибриллярными клубками в различных областях мозга (32).Aβ, пептид из 39–43 а.о., является основным компонентом сенильных бляшек. Это широко изученный токсичный фрагмент интегрального мембранного белка, известного как белок-предшественник амилоида (32). Aβ индуцирует гибель первично культивируемых нейронов посредством активации c-Jun и секреции лиганда Fas, при этом каскад апоптоза протекает JNK-зависимым образом (27). В частности, считается, что секретируемый лиганд Fas активирует каспазу 8 и индуцирует каскад событий, приводящих к гибели клеток.Кроме того, при болезни Альцгеймера, по-видимому, существует тесная связь между стрессом на уровне эндоплазматического ретикулума (ЭР) и гибелью нейронов (25, 26, 33). Недавно сообщалось, что каспаза 12 локализована в ER и активируется стрессом ER, и что нейроны коры с дефицитом каспазы 12 дефектны в апоптозе, индуцированном Aβ (25). Следовательно, каспаза 12, по-видимому, опосредует ER-специфический путь апоптоза и может способствовать нейротоксичности Aβ.

Обнаружение активации Bid в реальном времени и его последующая транслокация в митохондрии.

Чтобы изучить передачу сигналов апоптоза в отдельных нервных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии, мы исследовали эффекты трех индукторов апоптоза: Aβ, Tm, который индуцирует стресс ER (25, 26), и анти-Fas Ab, который работает как Fas-лиганд. , на клетках нейробластомы человека SK-N-SH. Мы выделили стабильные клоны, которые экспрессировали белки YFP-linker-CFP или YFP-Bid-CFP (рис. 5 A ). Затем клетки обрабатывали индукторами апоптоза, упомянутыми выше. Как показано на рис.5 B , мы наблюдали транслокацию Bid в митохондрии только в клетках, обработанных анти-Fas Ab (стрелки). Обработанные Аβ клетки демонстрировали стандартные признаки апоптоза, но локализация флуоресцентных белков в большинстве клеток (>94%) была воспроизводимо такой же, как и в необработанных клетках (см. табл. 1 и аналогичные изображения на рис. 5 C большего количества клеток которые были взяты независимо от показанных на рис. 5 B ). Эти клетки редко обнаруживали флуоресцентные белки, локализованные в митохондриях.Точно так же мы не смогли обнаружить локализацию каких-либо слитых белков в митохондриях в клетках, обработанных туникамицином (таблица 1, рис. 5 B и C Bottom ).

Рис. 5.

Флуоресцентные изображения YFP-Bid-CFP и YFP-линкер-CFP в клетках, обработанных различными индукторами апоптоза. ( A ) Клетки SK-N-SH стабильно трансфицировали pFRET-Bid или pFRET-линкером, и изображения регистрировали в фазово-контрастных условиях (фаза) и с фильтрами FRET, CFP и YFP.Linker относится к YFP-linker-CFP, а Bid относится к YFP-Bid-CFP. YFP-линкер-CFP и YFP-Bid-CFP равномерно диффундировали по клеткам. (Bar = 20 мкм.) ( B ) Клетки индуцировали для прохождения апоптоза с помощью анти-Fas Ab (Fas), Tm или Aβ. После обработки изображения записывали, как указано выше. Клетки, индуцированные апоптозом, также наблюдали при большем ( В ) и меньшем ( С ) увеличении. (Пруток = 10 мкм.)

Таблица 1.

Процент апоптотических клеток с митохондриальной локализацией расщепления Bid

Когда клетки SK-N-SH обрабатывали анти-Fas Ab, известным индуктором зависимого от каспазы 8 апоптоза, слитый белок Bid расщеплялся, и флуоресценция исходила в основном от CFP (указано стрелками на рис.5 B и C Top и таблица 1), с сопутствующим исчезновением FRET. Более того, как мы и ожидали, С-концевая область слитого белка была перемещена в митохондрии. Наши результаты показывают, что клетки SK-N-SH чувствительны к анти-Fas Ab и что каспаза 8 может быть активирована в этих клетках через вызывающий гибель сигнальный комплекс. Отрицательные результаты, полученные с туникамицином, подтверждают более раннее сообщение о том, что активация каспазы 8 не является необходимой для индукции апоптоза этим препаратом (34).

Данные против значительного участия Aβ в активации каспазы 8: противоречия могут возникать из измерений в реальном времени в отдельной клетке по сравнению с измерениями в больших клетках.

Существует сообщение о том, что Aβ является нейротоксическим агентом, индуцирующим секрецию лиганда Fas в первично культивируемых клетках (27). В нашей системе, хотя расщепление YFP-Bid-CFP каспазой 8 можно было четко обнаружить при обработке клеток Fas-лигандами, соответствующая активация Aβ была едва заметна в отдельных клетках при измерениях в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии.Противоречивые данные об участии Aβ в активации каспазы 8 могут быть согласованы с помощью настоящего анализа, если мы предположим, что Aβ не играет существенной роли в расщеплении прокаспазы 8. Важно отметить, что мы наблюдали апоптотические события в одиночных индивидуальных клетках, тогда как обнаружение активации каспазы 8 из небольшого числа апоптотических клеток через индуцирующий гибель сигнальный комплекс-зависимый путь могло быть усилено, когда в прошлом использовались объемные клетки.Поэтому вполне вероятно, что в клетках SK-N-SH какой-то другой основной путь (например, стресс ER) играет критическую роль в Aβ-зависимой гибели клеток.

Заключение

Таким образом, ( i ) мы разработали систему FRET с использованием YFP-Bid-CFP, и ( ii ) результаты, полученные с помощью этой системы in vitro и in vivo , согласуются с моделью, в которой активация митохондриального пути апоптоза приводит к апоптозу в клетках NIH 3T3.Наконец, ( iii ) мы продемонстрировали на отдельных клетках, что анти-Fas Ab может активировать каспазу 8, тогда как Tm и Aβ не смогли (заметно) этого сделать. Настоящие измерения в режиме реального времени в пределах одной клетки, в отличие от прошлых анализов, основанных на объемных клетках, позволяют нам предположить, что Aβ не играет существенной роли в расщеплении прокаспазы 8. Таким образом, функционально активный YFP- Слитый белок Bid-CFP должен быть очень полезным инструментом для дальнейшего анализа различных путей апоптоза в различных линиях культивируемых клеток.

Благодарности

Мы благодарим профессора Юкико Гото из Токийского университета и доктора Лауру Нельсон из Национального института передовых промышленных наук и технологий за полезные комментарии к рукописи. Это исследование было поддержано грантами Министерства экономики, торговли и промышленности (METI) Японии, грантом Организации развития новых энергетических и промышленных технологий (NEDO) Японии, грантом по содействию фундаментальным исследованиям в области инновационных биологических наук. (PROBRAIN) Японии и грант на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта, науки и культуры (MEXT) Японии.

Сноски

  • ↵‡ Р.О. и А.Н. в равной мере внесли свой вклад в эту работу.

  • ↵¶ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: tira{at}chembio.t.u-tokyo.ac.jp.

  • Этот документ был отправлен непосредственно (трек II) в офис PNAS.

Сокращения

  • Домен BH, домен гомологии Bcl-2

  • YFP, желтый флуоресцентный белок

  • CFP, голубой флуоресцентный белок

  • Aβ, β-амилоидный пептид

  • Тм, туникамицин

  • FRET, перенос энергии флуоресцентного резонанса

  • ER, эндоплазматический ретикулум

  • Copyright © 2002, Национальная академия наук
.