Икс коде лада: фото новая цена Х Код Concept, АвтоВаз опубликовал тизер кроссовера

Lada Kalina 2019 / 2020 года

Самым ярким экспонатом вазовского стенда ММАС-2016 безусловно стал концептуальный кроссовер Lada Xcode и не только из-за своего ослепляюще-желтого цвета: данный автомобиль по праву может считаться единственной абсолютной новинкой отечественного автогиганта на выставке среди прочих концептов, которые по сути являются новыми модификациями уже существующих моделей.

Сам же производитель позиционирует Xcode как возможное развитие модельного ряда Lada, основанное на X-стиле, что-то вроде дизайнерского концепта, каким в свое время стал трехдверный Xray, но по мнению многих журналистов и автоэкспертов нынешняя новинка представляет собой вовсе не абстрактное творение Стива Маттина, а реальный прототип будущей новой модели.

Некоторое время назад появились сведения о прекращении выпуска модели Лада Калина до 2019 года, поскольку АвтоВАЗ не видит смысла не только в обновлении вплоть до нового кузова, но и вообще выпускать ее одновременно с технически идентичной «Грантой», находящейся в более бюджетной ценовой категории.

Тем не менее, в виду относительной популярности отдельной модификации — а именно кросс-универсала, который в настоящее время обеспечивает примерно половину продаж от всего семейства «ягодной модели», производитель возможно не пожелает отказываться от выпуска дешевого переднеприводного кроссовера. И якобы именно новая модель Lada Xcode должна стать таким субкомпактным кроссовером вместо «Калины-Кросса» после 2019 года, для которой время на конвейере подходит к концу. Согласно другим слухам дизайнерский прототип «Икс-кода» готовят для нового поколения вазовского внедорожника «Нива», технической основой для которого послужит шасси от Renault Duster.

Однако, подобные сведения распространялись еще при бывшем президенте АвтоВАЗа Бу Андерссоне, новая же производственная стратегия российского автопроизводителя, принятая уже при Николя Море, предусматривает существование Lada Kalina еще как минимум на 2019-2020 годы с проведением рестайлинга в 2018-ом. Впрочем, не исключено, что хэтчбек и универсал данной модели в ближайшее время все же уйдут с конвейера, останется лишь так называемый кроссовер, которому сохранят оригинальное имя, но обвешают новыми кузовными панелями от Xcode.
В любом случае ждать такую возможную кросс-модель Лада Калина в новом кузове стоит на 2019 или 2020 год. Обзор самого концепта Xcode и размышления автоэкспертов о его перспективах на будущее представлены на видео ниже.

Обновление: Незадолго до презентации рестайлинговой версии Lada Granta в августе 2018 года в Сеть были выложены фотографии, на которых изображен кросс-универсал на базе модели Kalina с «мордой» от Весты. Задняя часть кузова на данном прототипе особых изменений не претерпела. Однако обозначение на месте номерного знака Granta Cross дает окончательно понять, что новая модель Лада Калина 2019 / 2020 года все же вольется в семейство Гранты, а сам бренд Kalina уйдет в историю, если конечно позже не будет возрожден в серийной версии компактного кроссовера Xcode.

Оценка FRET X для фингерпринтинга одиночных молекул белка

Доступность ресурсов

Ведущий контакт

Дополнительная информация и запросы на ресурсы и реагенты должны быть направлены и будут выполняться ведущим контактным лицом, Диком де Риддером (dick.deridder@ wur.nl).

Наличие материалов

• • Модельные пептидные последовательности из 40 остатков приведены в таблице S1.
• • Последовательности нитей имидж-сканера и стыковки приведены в таблице S2.

Детали метода

Маркировка пептидов

Специально разработанные полипептиды были получены от Biomatik (Канада) и имели постоянную последовательность скелета (таблица S1), отличающуюся только цистеиновыми заменами.Остатки цистеина в полипептидах восстанавливали 40-кратным молярным избытком трис(2-карбоэтил)фосфина (TCEP) в течение 30 мин, а затем донорно метили 6-кратным молярным избытком монореактивной малеимид-(5′) функционализированной ДНК в 50 мМ HEPES. рН 6,9 в течение ночи при комнатной температуре. Акцепторная стыковочная цепь была помечена одним лизином, расположенным на N-конце пептида. Для этого диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли до 50 % (об./об.) и повышали рН до 7,5 путем добавления NaOH.Затем мы добавили монореактивный N-гидроксисукцинимид (NHS)-эфир, функционализированный дибензоциклооктином (DBCO) (Sigma Aldrich, Германия) в 25-кратном молярном избытке и инкубировали в течение 6 часов при комнатной температуре. Свободный NHS-DBCO удаляли с помощью наконечников микропипеток со слоем C18 (Pierce) в соответствии с протоколом производителя. Наконец, монореактивную ДНК, функционализированную азидобензоатом (5′), добавляли в 5-кратном молярном избытке и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Полный список субстратов см. в таблицах S1 и S2.

Одномолекулярная установка

Все эксперименты проводились на специальной установке микроскопа.Использовали инвертированный микроскоп (IX73, Olympus) с полным внутренним отражением на основе призмы. В сочетании с твердотельным лазером с диодной накачкой 532 нм (Compass 215M/50mW, Coherent). 60-кратный иммерсионный объектив с водой (UPLSAPO60XW, Olympus) использовали для сбора фотонов от красителей Cy3 и Cy5 на поверхности, после чего фильтр с длинным проходом 532 нм (LDP01-532RU-25, Semrock) блокирует возбуждающий свет. Дихроичное зеркало (635 dcxr, Chroma) отделяет флуоресцентный сигнал, который затем проецируется на камеру EM-CCD (iXon Ultra, DU-897U-CS0-#BV, Andor Technology).Серию изображений EM-CDD записывали с помощью специально разработанной программы на языке Visual C++ (Microsoft).

Сбор данных для одиночных молекул

Проточные ячейки для одиночных молекул были подготовлены, как описано ранее (Chandradoss et al., 2014; Filius et al., 2020). Вкратце, чтобы избежать неспецифического связывания, кварцевые предметные стекла (G. Finkerbeiner Inc) протравливали кислотой пираний и дважды пассивировали полиэтиленгликолем (ПЭГ). Первый раунд ПЭГилирования проводили с помощью mPEG-SVA (Laysan Bio) и ПЭГ-биотина (Laysan Bio), после чего следовал второй раунд ПЭГилирования с помощью MS (PEG) ₄ (ThermoFisher). После сборки микрожидкостной камеры предметные стекла инкубировали с 20 мкл 0,1 мг/мл стрептавидина (Thermofisher) в течение 2 минут. Избыток стрептавидина удаляли 100 мкл T50 (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl). Затем в микрожидкостную камеру добавляли 50 мкл 75 пМ ДНК-меченого пептида. После 2 минут инкубации несвязанный пептид и избыток азид-ДНК из более ранней клик-реакции смывали 200 мкл T50. Затем 50 мкл 10 нМ донорно-меченых цепей имидж-сканера и 100 нМ акцепторно-меченых цепей имидж-сканера в буфере для визуализации (50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 500 мМ NaCl, 0,8% глюкозы, 0,5 мг/мл глюкозооксидазы (Sigma), 85 мкг/мл каталазы (Merck) и 1 мМ Trolox (Sigma)). Все эксперименты FRET с одной молекулой проводились при комнатной температуре (23 ± 2°C).

Анализ данных

Сигналы флуоресценции собираются при времени экспозиции 0,1 с, если не указано иное. Временные трассы впоследствии были извлечены с помощью программного обеспечения IDL с использованием специального сценария. С помощью файла сопоставления сценарий собирает отдельные горячие точки интенсивности в акцепторном канале и сопоставляет их с горячими точками интенсивности в донорном канале, после чего извлекаются временные трассы.Во время получения фильма зеленый лазер используется для возбуждения донорских флуорофоров Cy3. Для автоматического обнаружения событий связывания отдельных цепей флуоресцентного имидж-сканера мы использовали пользовательский код Python (Python 3.7, Python Software Foundation, https://www.python.org), использующий алгоритм кластеризации K-средних с двумя состояниями по сумме интенсивности донорной и акцепторной флуоресценции отдельных молекул для выявления кадров с высокой интенсивностью (Boutureira, Bernardes, 2015). Чтобы избежать ложных срабатываний, для дальнейшего анализа были выбраны только события связывания, которые длились более трех последовательных кадров.Рассчитывали эффективность FRET для каждого события связывания нити устройства визуализации и использовали для построения кимографа и гистограммы FRET. Популяции на гистограмме FRET автоматически классифицируются с помощью моделирования гауссовской смеси. Код автоматического анализа на Python находится в свободном доступе по адресу: https://github.com/kahutia/transient_FRET_analyzer2.

Моделирование

Моделирование отпечатков пальцев было создано с использованием модели складывания решетки, написанной на Python 3.7, далее. Код моделирования и анализа находится в свободном доступе на https://github.com/cvdelannoy/FRET_X_fingerprinting_simulation. Для запуска симуляций требуются установки python и conda.

Моделирование сворачивания белка было реализовано для включения ДНК-меток, прикрепленных к определенным остаткам, и учета их влияния на структуру белка. Решетчатые модели использовались из-за гораздо меньшей вычислительной мощности, необходимой для моделирования складывания, по сравнению с полностью атомистическими моделями, допускающими неограниченное движение, что достигается путем сведения каждой аминокислоты к псевдоатому и ограничения ее возможных положений вершинами решетки. Такие модели ранее использовались в приложениях, где были важны низкие вычислительные требования (Колински и Сколник, 2004; Абельн и др., 2014; Колуцца и др., 2003; Бьянко и др., 2017; Дейкстра и др., 2018; Ван Гилс и др., 2020). Схематический обзор конвейера моделирования приведен на рисунке S7. Процедура начинается с полностью атомарной нативной структуры, которая преобразуется в решетчатую структуру с отмеченными мечеными остатками. Затем эта структура перестраивается путем внесения локальных модификаций и расчета их влияния на энергию модели ( E _tot ), рассчитанную с помощью функции энергии.Модификации, которые уменьшают E _до , принимаются, тогда как те, которые увеличивают E _до , с большей вероятностью будут отброшены, чем больше они увеличивают E 9 0 Процедура завершается, когда все ДНК-метки помещаются в структуру, не вызывая стерических затруднений. Аспекты процедуры моделирования более подробно описаны ниже.

Структура решетки

Процедура моделирования решетки, используемая здесь, во многом похожа на ранее опубликованные приложения.В частности, модель, разработанная Abeln et al. (2014) использовалась в качестве отправной точки, однако кубическая решетка была заменена объемно-центрированной кубической (ОЦК) решеткой (рис. S1). Октаэдрическая элементарная ячейка ОЦК-решетки граничит с восемью соседними ячейками через свои шестиугольные грани и с четырьмя через квадратные грани. Учитываются только соединения через шестиугольные грани, так как это позволяет всем соединениям иметь одинаковую длину. В результате только четные координаты в решетке являются допустимыми вершинами для размещения остатков (Thompson et al., 2016). Эта реализация увеличивает количество контактов, которые каждый остаток, не являющийся концевой точкой, может образовывать с четырех до шести (не включая непосредственно соседние остатки), и увеличивает количество направлений, в которых может распространяться связь. В результате повышенная гибкость позволяет решетчатым моделям больше походить на исходные складки. Более того, альфа-спирали представлены лучше, поскольку решетка BCC допускает структуры, которые делают один правильный оборот на пять остатков.

Реализация метки

Поскольку точное влияние присутствия ДНК-метки на структуру белка неясно, мы полагались на несколько основных предположений, чтобы включить их в модель.Во-первых, мы предполагаем, что ДНК-метки предпочитают располагаться на периферии белка из-за их полярных остовов. Таким образом, мечение внутреннего остатка должно изменить локальную структуру, чтобы обеспечить достаточное пространство от остатка до поверхности, в то время как мечение остатка, который уже находится на поверхности белка, должно влиять на структуру менее серьезно. Это было реализовано путем добавления существенного энергетического штрафа, если в меченом остатке не было места для ДНК-метки, чтобы достичь периферии структуры без столкновения с основной цепью. Поскольку нуклеотиды ДНК более объемные, чем аминокислоты, мы учитываем это путем моделирования метки с объемом, охватывающим вершины на расстоянии до 2 вершин от основы метки (рис. S11). Во-вторых, мы предполагаем, что метки будут электростатически отталкиваться друг от друга. Это представлено введением минимального угла и двугранного угла между парами тегов, которые пространственно близки друг к другу в заданной конфигурации (рис. S10). Чтобы параметризовать этот эффект, мы сравнили предсказанные отпечатки пальцев модельных пептидов с 40 остатками с представленными экспериментальными данными и обнаружили, что значения воспроизводятся хорошо, если между метками, расположенными в пределах 20 Å друг от друга, установлен угол по крайней мере 70° и двугранный угол.Наконец, поскольку ДНК-метки блокируют или частично заменяют остаток, предполагается, что меченый остаток теряет способность взаимодействовать с другими остатками или способствует образованию вторичной структуры, включая дисульфидные мостики в случае мечения цистеином (рис.  8).

Смоделированные сценарии маркировки

В этой работе используются два сценария маркировки. В оптимальном сценарии все целевые остатки метятся, а нецелевые метки не происходит. В неоптимальном сценарии снижаются как эффективность, так и специфичность мечения в соответствии с процедурой, аналогичной Охайону и соавт.(2019 г.); каждый целевой остаток имеет 90%-ную вероятность быть помеченным с помощью своего специального химического состава, в то время как некоторая вероятность нецелевого мечения определена для одного или нескольких других типов остатков. Там, где это возможно, параметры эффективности и специфичности основаны на литературных данных (таблица S3).

Коллекция структур

Мы основываем решетчатые модели, используемые в наших симуляциях снятия отпечатков пальцев, на полностью атомистических структурах, хранящихся в PDB RCSB. Чтобы получить набор данных соответствующих структур, мы проанализировали все доступные записи PDB, соответствующие записям в наборе протеома человека Uniprot (UP000005640). Из 20 381 записи в протеоме было найдено 7 133 решенных структуры. Мы дополнительно отфильтровали этот список по качеству структуры, сохранив только те, у которых значение R-free ниже 0,21, и удалили структуры с неканоническими остатками, поскольку наша модель не содержит модификаторов энергии для этих остатков. Наконец, ожидается, что четвертичная структура будет потеряна во время подготовки образца, поэтому, чтобы избежать моделирования влияния потери других цепей на третичную структуру целевой цепи, мы удалили структуры, которые кристаллизовались как комплекс из нескольких цепей.После этих шагов фильтрации для нашего моделирования осталось 746 структур.

Модель решетки получается из полностью атомистической структуры путем сведения ее к ее позициям Cα и размещения каждого атома Cα в ближайшей вершине решетки, оставаясь при этом связанным с соседним атомом Cα, начиная с остатка с наименьшим индексом. Альфа-спирали вынуждены оставаться нетронутыми на решетке, сначала переводя вовлеченные атомы Cα в спираль, соответствующую решетке, а затем одновременно минимизируя расстояние между их соответствующими положениями решетки.

Поскольку для модельных пептидов с 40 остатками, помеченных в практических экспериментах, отсутствуют структуры PDB, исходные структуры для этих пептидов представляли собой растянутые конфигурации. Исходные структуры для сплайсоформ Bcl-X и PTGS1 были созданы с использованием сервера предсказания структуры RaptorX (Källberg et al., 2012, 2014).

Моделирование складывания

После инициализации модели решетки для минимизации энергии структуры используется метод Монте-Карло цепи Маркова (MCMC) E _tot .

ETOT = EAA + ESOL + ESS + EDSB + ETAG + EREG

Остаточное взаимодействие и остаток-растворитель взаимодействия Условия взаимодействия E _{E E SOL SOL 9002 SOL суммируются термины взаимодействия между контактными остатками или контакты остаток-растворитель, величина которых определяется эмпирически (Miyazawa and Jernigan, 1999). Энергия формирования вторичной структуры E ss адаптирована из Abeln et al.(2014) и получает произвольно высокий энергетический бонус -25, если образуется альфа-спираль или бета-лист, но только если данный остаток также был частью такой вторичной структуры в нативной складке. Альфа-спиральный остаток получает этот бонус, если формируется точная форма спирали (т. е. остатки от i до i +4 принимают одну и ту же относительную ориентацию на каждом шаге), в то время как бонус за формирование бета-листа применяется, если не -соседние остатки бета-листа примыкают друг к другу. Энергетический термин дисульфидного мостика E dsb несет произвольно высокий бонус в 50 за каждую пару контактирующих цистеинов.Каждый цистеин может вносить вклад только в одну связь за раз. Термин энергии метки E метка подвергается произвольно высокому штрафу энергии в 100 за каждый остаток, препятствующий кратчайшему пути от меченого остатка к периферии структуры. Наконец, термин регуляризации E reg влечет за собой штраф за большие структурные реорганизации, происходящие на одном этапе MCMC, поскольку мы обнаружили, что это помогает максимально сохранить естественную складку.}

Чтобы минимизировать энергию конструкции, можно применить три модификации (рис. S9). Модификация вращения ветвей вращает все псевдоатомы после случайно выбранной точки; модификация переворота угла изменяет положение одного псевдоатома на новое положение, не теряя контакта со своими соседями; и движение коленчатого вала делает то же самое для двух псевдоатомов. Обратите внимание, что эти модификации аналогичны тем, которые использовали Coluzza et al. (2003), с той разницей, что мы не ограничиваем углы поворота углов, а повороты ветвей менее ограничены, тогда как Coluzza et al.(2003) допускают поворот только на 180 и 90 градусов соответственно.

На каждой итерации MCMC процесса минимизации энергии одна из указанных модификаций применяется в случайном месте. Разница энергии, вызванная модификацией, определяет вероятность, с которой она будет принята; модификации, уменьшающие энергию модели или сохраняющие ее неизменной, всегда принимаются, в то время как модификации, увеличивающие энергию, все еще могут быть приняты с некоторой вероятностью, чтобы обеспечить лучшее исследование пространства поиска.Вероятность принятия модификации определяется как:

Paccept=min{1,exp(-ΔET)}

Здесь Δ E — разность энергий, а T — температура моделирования, безразмерный параметр, регулирующий вероятность принятия энергоувеличивающей модификации. Две модели оптимизируются одновременно в двух цепочках, при двух разных температурах моделирования (0,01 и 0,001). Высокотемпературная цепочка менее ограничена в принятии модификаций, увеличивающих энергию, что позволяет более широко исследовать пространство структурного поиска, в то время как более строгий критерий приемлемости низкотемпературной цепочки лучше подходит для поиска локального минимума. Два свойства объединяются, позволяя цепочкам обмениваться моделями после каждых 100 итераций MCMC. Вероятность обмена определяется следующим образом:

Pexchange=min{1,exp(ΔE⋅Δ1/T)}

Решетчатые модели оптимизируются максимум для 60 000 итераций MCMC с использованием двух отдельных цепочек. После каждых 500 итераций оценивают стерические препятствия, создаваемые ДНК-метками. Если стерических препятствий не осталось, дальнейшая оптимизация модели не проводится.

Извлечение отпечатков пальцев

Чтобы учесть тот факт, что структура может принять несколько конформаций в ходе измерений либо из-за естественного беспорядка, либо из-за присутствия ДНК-меток, отпечатки пальцев основаны на серии снимков структуры.После завершения моделирования фолдинга и нахождения структуры, вмещающей все ДНК-метки без стерических препятствий, выполняется еще 1000 шагов MCMC. Во время этих шагов снимки делаются с интервалом в 10 шагов, таким образом измеряя 100 слегка отличающихся конформаций. Для каждого снимка позиции красителя выбираются случайным образом из всех доступных направлений решетки. Если обнаруживается, что метки расположены ближе друг к другу, чем на 20 Å, между этими метками устанавливается минимальный угол и двугранный угол, равные 70 ° (рис. S10).Расстояния между положениями донора и акцептора красителя оцениваются по снимкам и усредняются по 10 последовательным конформациям, чтобы эмулировать движение молекулы в одном кадре. Используя это расстояние, эффективность FRET затем рассчитывается следующим образом:

Здесь R — смоделированное расстояние между донорным и акцепторным красителем, а R ₀ — радиус Фёрстера, который характеризует используемую пару красителей FRET ( R ₀ предполагалось постоянным при 54Å для пары FRET Cy3-Cy5 (Lerner et al., 2021)). Наконец, все значения FRET группируются и нормализуются по количеству смоделированных кадров для получения окончательного отпечатка пальца. Ширина бина используется здесь для представления разрешения наблюдения. Разрешение зафиксировано на уровне 0,01, если не указано иное, поскольку предыдущая работа показала, что такое разрешение может быть достигнуто с помощью FRET X (Filius et al., 2021). Если помечено несколько типов остатков, каждый тип остатков генерирует свой собственный отпечаток пальца, который группируется отдельно.

Классификация

Для классификации смоделированных отпечатков пальцев была реализована машина опорных векторов (SVM) с использованием пакета scikit-learn (v0.23.2) (Педрегоса и др., 2011). Поскольку более высокое разрешение также более чувствительно к шуму из-за нестабильных отпечатков пальцев, разрешение настраивается во время обучения с шагом 0,01 E для обеспечения максимальной точности обучения.

Резонансный анализ переноса энергии флуоресценции (FRET)

Анализ переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET)

Мембранные белки составляют 1/4-1/3 от общего числа 30000 белков, кодируемых геномом человека. Мембранные белки играют важную роль в различных сложных и уникальных клеточных процессах, включая транспортировку материалов, распознавание клеток, иммунный ответ, передачу и регуляцию сигналов, а также перенос энергии, и др. . Почти 70% известных или исследуемых мишеней лекарственных средств представляют собой мембранные белки. По-прежнему остается сложной задачей определение структур и выполнение функциональных анализов мембранных белков.

Компания Creative Biostructure создала превосходную сервисную платформу мембранного белка, созданную группой опытных профессионалов.Наш полный набор услуг по мембранным белкам, включая экспрессию и очистку, кристаллизацию и определение, а также различные функциональные анализы как in vivo , так и in vitro , ускоряет и ускоряет ваши научные исследования. Creative Biostructure может разработать и предоставить индивидуальный анализ Mempro™ флуоресцентно-резонансного переноса энергии (FRET) или анализ FRET для функционального исследования взаимодействия мембранных белков.

Межбелковые взаимодействия имеют решающее значение для сигнальных сетей мембранных белков.Однако резонансная передача энергии флуоресценции  может иметь место только в том случае, если расстояние между донором и акцептором не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий мембранных белков .

Резонансный анализ переноса энергии флуоресценции ( FRET ), один из наших наиболее передовых и желательных методов с широким диапазоном применения, выполняет анализы для прямого определения состояния олигомеризации и степени олигомеризации мембранных белков в их нативной среде.FRET представляет собой зависящее от расстояния взаимодействие между флуоресцентными парами донор-акцептор в непосредственной близости, при котором энергия флуоресценции передается от возбужденного донора к подходящей молекуле-акцептору без излучения. Эффективность FRET чрезвычайно зависит от расстояния между донором и акцептором и от перекрывающихся спектров излучения донора и возбуждения акцептора.

Рисунок 1. Схема фотофизического процесса-FRET (Molecules, 2012)

FRET может иметь место только в том случае, если расстояние между донором и акцептором не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий мембранных белков.Creative Biostructure может предоставить платформу Mempro™ FRET для выполнения структурного и функционального анализа мембранных белков.

FRET может обеспечивать не только качественные измерения, но и количественные данные в исследованиях функции мембран. Creative Biostructure разработала полный набор методов FRET , таких как 1) Upconversion FRET , 2) Photochromic FRET , 3) Single-Molecule-FRET и 4) FRET аль . Creative Biostructure является вашим компетентным и профессиональным научным партнером для выполнения всех видов приложений FRET мембранных белков, в том числе:
1. Структура и конформация мембранных белков,
2.Пространственное распределение мембранных белков,
3. Олигомеризация мембранных белковых комплексов,
4. Мембранный белок участвует во взаимодействиях рецептор/лиганд,
5. Взаимодействие между мембранными липидами и мембранными белками.

Рис. 2. Внутримолекулярный и межмолекулярный FRET (Current Opinion in Structural Biology, 2001)

Рис. 3. Применение одномолекулярного FRET (J. Am. Chem. Soc., 2013)

Рис. белков, липидов и лигандов с помощью FRET (PNAS, 2013)

Компания Creative Biostructure разработала ряд методик для определения FRET.Как правило, мы предлагаем три специальных подхода, которые оказались особенно полезными на основе практических соображений:
1. Фотообесцвечивание донора и акцептора
FRET можно получить путем доступа к скорости обесцвечивания донора с присутствием акцептора и без него. Основные два преимущества этого подхода: относительно прямолинейный, легко реализуемый. Требуются соответствующие комплекты фильтров и мощный источник света, позволяющие обесцвечивать акцептор.
2. Сенсибилизированное излучение
Сенсибилизированное излучение является простейшим методом обнаружения FRET, и наиболее идеальным условием для этого метода является полное разделение каналов донора и акцептора и отсутствие перекрестных помех между ними.
3. Флуоресцентная микроскопия с визуализацией в течение всего срока службы
Флуоресцентная микроскопия с визуализацией в течение всего срока службы, также называемая FLIM, может использоваться для картирования пространственного распределения времени жизни флуорохромов как на микроскопических изображениях, так и в живых клетках. Creative Biostructure может определять точное пространственное расположение или распределение мембранных белков с высоким разрешением и специфичностью в живых клетках.

Creative Biostructure также предоставляет ряд услуг по проведению функциональных анализов Mempro™. Пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам для получения подробной цитаты.

Ссылки:
H.C. Ishikawa-Ankerhold, и др. . (2012). Усовершенствованные методы флуоресцентной микроскопии — FRAP, FLIP, FLAP, FRET и FLIM. Молекулы , 1 7 (3): 4047-4132.
К. Труонг и М. Икура. (2001). Использование микроскопии визуализации FRET для обнаружения межбелковых взаимодействий и конформационных изменений белков in vivo. Текущее мнение по структурной биологии , 11 : 573-578.
В. Бэ, и др. . (2013). Наблюдение в режиме реального времени за образованием множественных белковых комплексов с помощью одномолекулярного FRET. Дж. Ам. хим. Soc ., 135 (28): 10254-10257.
К. Мацусита, и др. . (2013). Ориентация трансмембранной спирали влияет на связывание с мембраной внутриклеточного околомембранного домена в пептидах рецептора Neu. Проц. Натл. акад. науч. США, 110 (5): 1646–1651.

Только для исследовательских целей. Не для использования в диагностических или терапевтических процедурах.

Одномолекулярный FRET и конформационный анализ бета-аррестина-1 посредством расширения генетического кода и реакции Se-click

* Соответствующие авторы

^и Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии, Китайская академия наук, Экономическая зона аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь, Китай

^б Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Чилу, Шаньдунский университет, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань, Шаньдун, Китай
Электронная почта: сунджинпэн@sdu. edu.cn

^в Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский передовой инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, район Хайдянь, Пекин, Китай
Электронная почта: чуньлай @ Цинхуа.edu.cn

^д Кафедра физиологии и патофизиологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Пекинский университет, Ключевая лаборатория молекулярной сердечно-сосудистой науки, Министерство образования, округ Хайдянь, Пекин, Китай

^и Институт биофизики Китайской академии наук, район Чаоян, Пекин, Китай

^ф Университет Китайской академии наук (UCAS), район Шицзиншань, Пекин, Китай

^г Шэньчжэньский институт трансфузионной медицины, Шэньчжэньский центр крови, район Футянь, Шэньчжэнь, Китай

^ч Школа наук о жизни, Университет науки и технологий Китая, район Баохэ, Аньхой, Китай

^я Школа биологических наук и технологий, Цзинаньский университет, Цзинань, Шаньдун, Китай

DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматизированной классификации данных FRET одной молекулы с использованием глубокого обучения

Основные версии:

1) Неясно, как предварительная подготовка модели может учитывать бесконечные возможные состояния FRET/время жизни/занятости/пути перехода/шум и т. д.Как это может не искажать результаты, чтобы искать трассы, которые аналогичны SNR и т. Д. Данным обучения? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в обучающем наборе данных, равная 0,2, может сместить анализ в сторону долгоживущих состояний FRET. Авторы должны прокомментировать это.

Это действительно очень правильный комментарий, и он играет центральную роль в процессе, поскольку существует бесконечное число возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к необъективному выбору трасс.Мы благодарим рецензентов за то, что они позволили нам прокомментировать это, поскольку это могло быть неясно в рукописи.

Чтобы внести как можно меньше смещения в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную долю всего пространства smFRET, единообразно отбирая большое количество бесконечных возможных перестановок данных ( состояния FRET/времени жизни/занятий/путей перехода/шумов). ) . Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

a) FRET состояния и занятости .Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. е. случайная однородная выборка повторялась до тех пор, пока требование не было выполнено). способность отличать фактические переходы от шумовых флуктуаций. Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3A.Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET» в исправленной версии. Кроме того, мы исправили легенду к рисунку 1 — дополнение к рисунку 3A на «трассы smFRET были сгенерированы с 1-4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки было указано, что трассы были сгенерированы либо с 1, 2 или 3 говорится в исходном представлении.

b) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходной заявке «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра трассы из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется 90 382 между 90 383 0 и 0,2. Вероятности перехода релевантны 90 382 между 90 383 состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2 комбинированная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,2*(4-1 состояния)=0.6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями и вероятностью перехода между состояниями, равной 0,01, комбинированная вероятность перехода в любой заданной системе координат составляет 0,01*(2-1 состояние)=0,01. Таким образом, среднее время жизни вышеупомянутых систем составляет 1/0,6=1,7 кадра и 1/0,01=100 кадра соответственно. Распределение времени жизни всех обучающих данных представляет собой равномерно взвешенное среднее по экспоненциальному спаду для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трасс выборки вероятностей перехода равномерно между 0 и 0,2 на 2-4 трассах состояния подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рис. 1 — дополнение к рисунку 3B). Следовательно, мы отбираем широкий диапазон вероятностей перехода, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь походить на большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 — дополнение к рисунку 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных».

c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая генерируется случайным образом из переходной матрицы с вероятностями, отобранными, как описано выше. Цепь Маркова каждой смоделированной трассы создается с использованием реализации скрытой модели Маркова в пакете Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные единообразно отбирают подмножество всех возможных путей перехода, мы построили график плотности перехода n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует совершенно случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта важная информация не была реализована в исходной заявке, мы добавили график в качестве нового рисунка 1 — дополнение к рисунку 3C и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Синтетическое создание данных smFRET».

г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут использоваться для выборки широкого диапазона уровней шума в зависимости от биологической системы, инструментов, экспериментальной установки и т. д. Чтобы охватить широкий диапазон возможных уровней шума, мы предприняли следующие шаги: Сначала были сгенерированы интенсивности донора и акцептора для каждой трассы. от базовых истинных значений FRET.Затем к интенсивностям добавлялся шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума сверху был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы оправдать выбранный диапазон значений σ, мы построили смоделированные распределения FRET при различных уровнях шума, как показано на рис. 1 (дополнение к рисунку 4). конкретного SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не предвзята к конкретному SNR в заданном диапазоне значений σ.Мы разъяснили в пересмотренной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение», что в режиме, когда скорости перехода аналогичны временному разрешению изображения, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Моделирование трассировки и переобучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки ввести как можно меньше систематических ошибок путем однородной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может быть какое-то смещение, определяющее пределы интервалов выборочных параметров. Поэтому, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассировки FRET могут быть легко смоделированы на основе заданных пользователем параметров (см. рис. 1 — дополнение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN по нашим инструкциям (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью при выборе «чистых трасс» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трасс, как правило, больше не является стандартным средством для анализа данных smFRET, учитывая наличие свободно доступных автоматических альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трасс.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

Мы хотели бы подчеркнуть, что основной целью этой рукописи является предоставление интуитивно понятной платформы, требующей минимального вмешательства человека, которая, как прокомментировали рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмента», вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и управляемых экспертами в данной области. Мы также признаем, что ручной выбор трасс не должен быть стандартным средством для анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных программных пакетов для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET , поскольку обозреватели предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на значениях интенсивности и FRET. Очистка трасс за пределами этих простых порогов часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более совершенную сортировку по интенсивности донора/акцептора, среднему значению FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более широкие возможности автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, отличных от ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al. , 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Яо и др., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих многочисленных критериях и точно определять свои собственные, оптимизированные для работы в их конкретных системах (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Цубояма и др., 2018; Ву и др., 2018; Яо и др., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную погрешность в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило поле smFRET.

Чтобы непосредственно ответить на комментарии рецензентов, мы провели два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, где достоверность известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, которые имеют расширенные возможности сортировки, с наборами экспериментальных данных, опубликованными другими группами.

В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трасс smFRET с 1800 смоделированными трассами без smFRET (рис. 4 — дополнение к рисунку 3A и материалы и методы для распределений FRET и описания параметров, соответственно) и реконструировали файлы tif, которые соответствовали бы для необработанных данных smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные без ALEX, поскольку iSMS оптимизирована для данных ALEX, а HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными без ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с использованием показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), интенсивности, стехиометрии и порогов FRET в iSMS, порогов интенсивности. в HAMMY и пороги FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое распределение FRET наземной истины с различными уровнями детализации, в то время как простая интенсивность и пороговые значения FRET HAMMY и ebFRET потребуют дальнейшей сортировки для достижения оптимальных результатов. Примечательно, что DeepFRET сортирует трассировки, по крайней мере, так же или даже лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рис. 4 — дополнение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать наземным достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где истина неизвестна, задача становится более сложной, а параметры точной настройки могут быть предвзятыми, особенно для неспециализированных пользователей. Единая пороговая классификация, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, которые смогут воспользоваться преимуществами этого инструмента.

Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных без ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al. , 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы практически использовали настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные для первых 10 кадров каждой трассы, сводя к минимуму обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНЕ. Наш анализ показывает, что все три программных пакета способны воспроизводить опубликованные дистрибутивы FRET из необработанных tif-файлов с небольшим расхождением (рис. 4 — дополнение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует эквивалентную или превосходящую производительность по сравнению с существующими сложными пакетами программного обеспечения, в том числе на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут перемещаться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать данные как ALEX, так и не-ALEX воспроизводимым образом, требующим минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, и , что позволяет большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмент. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4, дополняющий рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый абзац в раздел, в котором явно обсуждается сравнение смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

3) В том же духе лучший способ доказать эффективность анализа трассировки DeepFRET — это взять несколько наборов данных и сравнить анализы HAMMY, ebFRET и т. д. с DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами для двух экспериментальных наборов данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рис. 4 — дополнение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные дистрибутивы smFRET, используя простой порог качества 0,80, без дальнейшего вмешательства человека и, кроме того, наравне или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, которые могут потребовать специальных знаний пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили в рукопись новый рисунок 4 — дополнение к рисунку 4.

4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение, в котором говорится о случаях, когда их инструмент может дать сбой, будет полезно для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развивать его. Например, в обсуждении в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные следы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал из эксперимента [т. е.г. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

Следуя комментариям рецензентов, мы добавили новый абзац в раздел «Обсуждение», в котором излагаются ограничения текущей версии DeepFRET и то, что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как указывалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными двухцветными данными smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, которые обсуждаются в исправленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRET-Model), как описано в разделе «Материалы и методы».

Каталожные номера:

Азнаурян М., Сондергаард С., Ноер С.Л., Шиётт Б., Биркедал В., 2016. Прямой взгляд на сложную многопутевую укладку теломерных G-квадруплексов. Нуклеиновые Кислоты Res. 44, 11024– 11032. doi:10.1093/nar/gkw1010

Фессл, Т. , Уоткинс, Д., Оатли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Динамика действие аппарата Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi:10.7554/ eLife .35112

Гоуг Дж., Гутерц Н., Крамм К., Дергай О., Абаскаль-Паласиос Г., Сатья К., Кузен П., Эрнандес Н., Громанн Д., Ваннини, A., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразой III. Нац. коммун. 8, 130.

doi:10.1038/s41467-017-00126-1

Schärfen, L., Schlierf, M., 2019. Мониторинг индуцированных белком конформационных изменений ДНК в режиме реального времени с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

doi:10.1016/j.ymeth.2019.02.011

Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта с помощью различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. doi:10.1016/j. molcel.2018.04.010

Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментативного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. Дж. Физ. хим. Б 122, 6179–6187.

doi:10.1021/acs.jpcb.8b02374

Yao, C., Sasaki, H.M., Ueda, T., Tomari, Y., Tadakuma, H., 2015. Одномолекулярный анализ реакции расщепления мишени ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Ячейка 59, 125–132. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.015

https://doi.org/10.7554/eLife.60404.sa2

Как читать гитарные аккорды: основное руководство

Хотите научиться читать гитарные аккорды? Вы находитесь в правильном месте. Мы собираемся показать вам ВСЕ возможные способы чтения гитарных аккордов.

В этом бесплатном уроке вы узнаете:

• 3 обязательных урока о том, как читать гитарные аккорды.
• 2 простых и быстрых совета, которые помогут вам читать аккорды.
• Секрет улучшения ваших знаний об аккордах.

Более 100 000 учеников, изучающих гитару, получают наши советы и руководства по игре на гитаре мирового класса прямо на почту: нажмите здесь, чтобы присоединиться к ним

Прежде чем мы объясним, как читать гитарные аккорды, вы должны знать, что гитарные аккорды могут быть представлены различными способами.

В этом уроке мы покажем вам 3 самых популярных способа чтения гитарных аккордов. Это:

• Коробки для аккордов.
• Табы для гитары.
• Нотная запись.

Давайте рассмотрим различные способы научиться читать гитарные аккорды.

Как читать блоки аккордов?

Это САМЫЙ распространенный способ чтения гитарных аккордов. Если вы хотите научиться играть на гитаре, вы должны научиться читать аккорды.

Что такое коробка аккордов?

Коробка для аккордов — это визуальное представление грифа. Окно аккордов подскажет вам, где разместить пальцы на грифе.

В этом примере мы будем использовать аккорд Em.

Чтобы выучить аккорд Em, перейдите сюда: Как играть на аккорде Em

Коробка для аккордов Пример

Эта коробка является визуальным представлением того, как аккорд Em выглядит на грифе.

Черные кружки показывают, куда вы кладете пальцы.

Вот как это будет выглядеть на реальной гитаре:

Вы видите, как аккорд Em совпадает с ладами и струнами на грифе? Это все коробка аккордов!

Если это займет некоторое время, чтобы понять, не волнуйтесь. Все учатся с разной скоростью. Не торопитесь 🙂

Изучите 12 САМЫХ ЛЕГКИХ аккордов для начинающих с помощью нашего знаменитого БЕСПЛАТНОГО руководства

✓   Хватит сопротивляться. Начать заниматься музыкой.

✓  Изучите 12 удобных для начинающих версий на каждый аккорд .

✓  Это наше самое популярное руководство, которое быстро улучшит ваши навыки владения аккордами.

Как выглядит аккорд Em в реальной жизни?

Вот как выглядит аккорд Em на настоящей гитаре:

Чтобы сыграть этот аккорд:

• Найдите 2-й лад струны ля. Поместите свой 1-й палец сюда.
• Найдите 2-й лад струны ре. Поместите 2-й палец сюда.
• Играй на всех струнах.

Следующие струны в этом аккорде оставлены открытыми.

• Низкая ми струна. (6-я струна)
• G струна. (3-я строка)
• Б струна. (2-я строка)
• Струна High E. (1-я строка)

Так как эти струны открыты, их не следует напрягать. Убедитесь, что они звучат красиво и четко.

Вот и все!

Потратьте некоторое время на сравнение настоящего аккорда Em с версией в окне аккордов, это поможет вам понять, как работают блоки аккордов.

Важно, чтобы вы понимали, как читать гитарные аккорды.

Вот пара часто задаваемых вопросов, которые возникают ВСЕ время.

Иногда я вижу цифры внутри кругов вместо черных точек.

Что это значит?

Числа относятся к вашим пальцам, например:

Возможно, вы видели аккорд Em, написанный так:

1 и 2 относятся к тому, какие пальцы вы используете.

Иногда НАМНОГО лучше использовать определенные пальцы, это облегчает игру аккордов.

Вот как выглядит аккорд Em:

Обратите внимание, как используются 1-й и 2-й пальцы.

Как насчет номеров строк?

Часто на полях аккордов вы видите числа в нижней части поля аккордов. Это относится к номерам строк.

Вот так:

• Номера ваших пальцев ВСЕГДА будут в поле аккордов.
• Номера струн ВСЕГДА будут снаружи рамки аккордов.

Что означают буквы «X» и «O» на коробке аккордов?

«X» относится к струнам, на которых вы не играете. «О» относится к струнам, на которых вы играете.

Давайте посмотрим на этот аккорд D:

Для этого примера:

• Не играйте на нижней струне E. (6-я струна)
• Не играйте на струне ля. (5-я строка)
• Сыграйте струну ре (4-я струна) и остальные аккорды!

Как насчет чисел на боковой стороне коробки аккордов?

Это относится к ладам на гитаре.

Аккорды

не всегда используются конкретно на первых трех ладах гитары. Часто вы увидите цифры сбоку на коробке с аккордами.

Вот классический пример:

В этом примере начните аккорд на 7-м ладу.

Я видел аккорды, записанные цифрами, что это значит?

Часто многие гитаристы ленятся и не используют ящики для записи аккордов.

Иногда гитаристы записывают аккорды численно. Вы можете увидеть это на таких сайтах, как Ultimate Guitar или Facebook.

Если аккорд Em записать численно, вот как это будет выглядеть: 022000

Здесь каждая цифра относится к ладу, на котором вы играете. Формат этого означает, что вы не можете указать, какие пальцы использовать.

Порядок номеров соответствует каждой гитарной струне. Он выложен так: EADGBE

Вот пример:

Для этого примера давайте разберем, как будет записан аккорд Em.

6-я струна (ми) = 0 (Здесь пальцев нет, эта струна оставлена ​​открытой.)

5-я струна (A) = 2 (Здесь нужно зажать 2-й лад струны A.)

4-я струна (ре) = 2  (Здесь вы должны зажать 2-й лад струны ре.)

3-я струна (G) = 0  (Здесь нет пальцев, эта струна остается открытой.)

2-я струна (B) = 0  (Здесь нет пальцев, эта струна остается открытой.)

1-я струна (E) = 0 (Здесь нет пальцев, эта струна остается открытой.)

Что делать, если числа стоят в ряд?

Часто один и тот же аккорд пишется вертикально.Вот как будет выглядеть аккорд Em:

.

0

2

2

0

0

0

Это все еще аккорд Em, однако он написан вертикально.

Это может сбивать с толку, так как люди часто путают строки. (Этот пример начинается с 1-й струны, струны в обратном порядке. Иногда из-за Интернета бывает трудно понять аккорды)

Важно, чтобы вы могли видеть, как «022000» соответствует вашему аккорду Em.

Надеюсь, эта коробка аккордов поможет вам понять. Вы видите, как каждая фигура соединяется?

Что, если я увижу «X» в этом формате?

Вы можете применить точно такое же правило для X в письменном формате.

Всякий раз, когда вы видите «X», не играйте на этой струне.

Вот пример:

Аккорд

A D можно записать так:

.

ХХ0232

Или вот так:

Х

Х

0

2

3

2

Независимо от того, в каком направлении находится это поле с написанными аккордами, цель здесь — сыграть аккорд.

Обратите внимание, как «XX0232» соответствует аккорду.

Коробки для аккордов могут быть представлены различными способами

Остерегайтесь мошеннических блоков аккордов, часто это может сбивать с толку, когда вы видите другое изображение блока аккордов. Используйте свою инициативу, чтобы различать различные макеты блоков аккордов.

Вот несколько классических примеров того, как читать гитарные аккорды:

Как читать гитарные аккорды на вкладке

Во-первых, давайте посмотрим на аккорд Em в форме табулатуры.

В отличие от блоков аккордов, номера на вкладке относятся к ладам, на которых вы играете.

На большинстве табуляторов для любительских гитар НИКАКИХ указаний на то, какие пальцы следует использовать, НЕТ. Однако, если вы возьмете вкладку из профессиональной книги вкладок, она подскажет, какие пальцы использовать.

Обычно это находится в нижней части вкладки следующим образом:

Для этого примера:

• Используйте 1-й палец на 2-м ладу струны A.
• Используйте 2-й палец на 2-м ладу струны D.

Если у вас есть зачетная книжка или официальный учебник по музыке, вкладка покажет вам, какие пальцы использовать. На таких сайтах, как Ultimate Guitar, это встречается реже.

Как читать табулатуру на гитаре?

Вкладка представлена ​​так:

• Вертикальные линии представляют каждую строку.

Вертикальные линии — визуальное представление каждой гитарной струны.

От нижней строки до верхней строки идут так:

Вот так:

Когда вы смотрите на вкладку гитары, это идентичное представление того, где находятся ваши гитарные струны.

Цифры обозначают, на каких ладах вы играете

Каждый раз, когда вы видите число на вкладке, играйте на соответствующем ладу на правильной струне.

Например, вот аккорд C, написанный на рамке для аккордов:

Вот как это будет выглядеть в форме вкладки:

Вы видите, как номера вкладок соотносятся с ладами?

В чем разница между отдельными нотами и аккордами на табах?

При воспроизведении отдельных нот на вкладке каждая нота идет одна за другой.

Вот так:

Чтобы выучить несколько эпических табулатур для гитары для начинающих, перейдите сюда: Табы для гитары для начинающих: 20 простых песен, которые отлично звучат

Когда вы играете аккорд, ноты накладываются одна на другую. Вот так:

 

На каких струнах играть?

В отличие от блоков аккордов, «X» и «O» не существуют в табуляции.

На вкладке, если заметки нет. Не играй в это.

На вкладке всегда будет указано только то, во что вы должны играть, а не то, во что вам не следует играть.

Чтобы узнать больше о том, как читать табулатуры на гитаре, перейдите сюда: Как читать табы на гитаре

Зачем мне учиться читать гитарные аккорды?

Очень важно научиться читать гитарные аккорды. Вот 3 причины, по которым вам стоит научиться читать гитарные аккорды.

1) Изучение аккордов повышает вашу музыкальность

99% всего, что вы когда-либо делаете на гитаре, связано с аккордами. Без аккордов вы не сможете разучивать песни, писать музыку, заниматься творчеством или повышать свою музыкальность.

Все на гитаре основано на аккордах. Если вы не умеете читать гитарные аккорды, вы не станете гитаристом, которым хотите быть.

2) Коробки с аккордами часто используются в песнях

На таких сайтах, как Ultimate Guitar, поля аккордов и табы часто используются в качестве справочного материала, помогающего научиться играть песни.

Если вы не понимаете, как читать аккорды на гитаре, вы никогда не сможете играть ни одну песню!

Чтобы научиться играть простые песни, перейдите сюда: 10 простых песен на гитаре

Хотите получать бесплатные советы по игре на гитаре и видеоуроки на свой почтовый ящик?

Присоединяйтесь к более чем 100 000 других изучающих игру на гитаре и подпишитесь на нашу рассылку советов по игре на гитаре по электронной почте.(Это бесплатно.)

Мы вышлем вам серию уроков, которые поднимут вас на новый уровень вашего гитарного пути.

Узнайте, как все быстро, легко и эффективно сочетается друг с другом. Мы делимся советами ниндзя (для моментального удовольствия!), а также вечными основами, которые углубят ваше понимание.

3) Помогает понять теорию

Научившись читать аккорды на гитаре, вы сможете понять теорию. Один из самых быстрых и быстрых способов понять теорию музыки — использовать свою гитару в качестве эталона.

Когда вы научитесь читать гитарные аккорды, это поможет вам играть аккорды.

Аккорды составляют БОЛЬШУЮ часть музыкальной теории, поэтому, если вы знаете, как читать гитарные аккорды, это может помочь вам понять теорию игры на гитаре.

Как читать гитарные аккорды с помощью нотной записи

90% начинающих гитаристов не нужно уметь читать ноты. Однако этот навык может оказаться полезным, когда вы станете гитаристом среднего/продвинутого уровня.

Вот как выглядит аккорд Em на нотоносце: (Это выглядит немного пугающе, но не беспокойтесь об этом прямо сейчас!)

Этот формат известен как:

• Посох.
• Ноты.
• Музыкальная партитура.

Каждая линия на нотоносце представляет собой музыкальную ноту.

Аккорды создаются с помощью групп нот. Поэтому, когда вы видите аккорд Em в партитуре, каждая нота аккорда накладывается одна на другую.

Если вы начинающий гитарист, вам НЕ НУЖНО учиться читать ноты. Аккорды на гитаре учить необязательно.

Однако выучить партитуру может быть невероятно полезно, так как это позволяет вам общаться с музыкантами, играющими на других инструментах.

 Трубач не умеет читать гитарные табулатуры или аккорды. Однако они понимают нотную запись.

Если вы когда-либо играли с другим музыкантом, вы могли общаться с ним через партитуру.

Учитесь читать гитарные аккорды по нотам только в том случае, если вам интересно узнать о нотации или если вам это нужно для конкретного выступления.

Какой ты гитарист?

Пройди наш 60-секундный тест и получи свои результаты: Пройди тест

Хотите получать бесплатные советы по игре на гитаре и видеоуроки на свой почтовый ящик?

Присоединяйтесь к более чем 100 000 других изучающих игру на гитаре и подпишитесь на нашу рассылку советов по игре на гитаре по электронной почте. (Это бесплатно.)

Мы вышлем вам серию уроков, которые поднимут вас на новый уровень вашего гитарного пути.

Узнайте, как все быстро, легко и эффективно сочетается друг с другом. Мы делимся советами ниндзя (для моментального удовольствия!), а также вечными основами, которые углубят ваше понимание.

Популярные уроки

Как научиться играть на гитаре: программа из 11 шагов для начинающих

10 простых песен для начинающих

Как играть на гитаре

Как выбрать идеальную гитару для начинающих

Объяснение гитарных нот: руководство для начинающих

Как играть на соло-гитаре

3 простых способа играть в Bm

Больше крутых вещей для гитары

Узнайте о Национальной академии гитары: О нас

Посетите наш канал на YouTube, чтобы посмотреть забавные видеоролики об игре на гитаре.

Присоединяйтесь к нам на Facebook и получайте ежедневные советы по игре на гитаре.

Слушайте наш подкаст «Обучение игре на гитаре», чтобы быстро прогрессировать.

Посмотрите наши бесплатные уроки аккордов.

 

Наносистемы FRET с синхронизацией по времени для быстрой и чувствительной внутри- и внеклеточной флуоресцентной визуализации

Внеклеточный FRET Tb-to-QD с использованием иммунного окрашивания

использовали антитела цетуксимаб и матузумаб и однодоменные антитела EgA1 и EgB4 V _H H (вариабельный домен тяжелой цепи) (нанотела), которые распознают различные эпитопы EGFR ( 33 , 34 ).КТ eBioscience eFluor 650NC, излучающие на длине волны 650 нм (QD650), были функционализированы поверхностью с помощью цетуксимаба и EgB4, а спектроскопия поглощения в ультрафиолетовом и видимом (УФ-видимом) диапазонах показала, что средняя степень мечения (DOL) составляла приблизительно 6,8 цетуксимаба на QD650 и 18,1 EgB4. за QD650. Матузумаб и EgA1 реагировали с функционализированным N -гидроксисукцинимидом (NHS) Lumi4-Tb (Tb), и DOL составляли ок. 4,1 ТБ на матузумаб и 2,2 ТБ на EgA1. Затем мы инкубировали живые клетки A431 в культуральной среде, содержащей QD650-цетуксимаб (9.5 нМ) и матузумаб-Tb (100 нМ) в течение 30 мин, промывали клетки и сразу помещали их на предметное стекло микроскопа для визуализации. Визуализация TG выявила надежные, долгоживущие сигналы PL как в каналах обнаружения Tb (494 нм), так и в каналах обнаружения QD (650 нм) (рис. 2А). Аналогичные результаты были получены при совместной инкубации клеток A431 с конъюгатами нанотел QD650-EgB4 и EgA1-Tb (рис. 2B). Напротив, едва ли какой-либо заметный долгоживущий сигнал TG обнаруживался в канале КТ, когда клетки инкубировали только с конъюгатами КТ или конъюгатами Tb (рис.2, С и Г). Кроме того, Tb-опосредованный FRET не обнаруживался на клетках A431, меченных совместно с матузумабом-Tb и антителами, специфичными к рецептору эпидермального фактора роста 2 (HER2), конъюгированными с QD (рис. S1), хотя TG Tb PL и стационарное состояние (SS) Оба КТ ФЛ могли быть обнаружены. Таким образом, путем устранения короткоживущих неспецифических сигналов можно было четко визуализировать межмолекулярный FRET как между двумя разными антителами иммуноглобулина G, так и между двумя разными однодоменными антителами, что продемонстрировало применимость пары FRET Tb-QD для визуализации белок-белковых взаимодействий на клеточные мембраны. Кроме того, эту систему FRET также можно использовать для гомогенной (без этапов разделения или промывки) визуализации белков, которые экспрессируются на клеточных мембранах, аналогично анализам FRET in vitro ( 28 , 35 ). Это приложение было бы особенно интересно для визуализации живых клеток или мультиплексирования.

Рис. 2 FRET внеклеточного Tb-to-QD с использованием иммуноокрашивания EGFR.

( A и B ) FRET Tb-to-QD, обнаруженный на клетках A431 с QD- и Tb-конъюгированными антителами (A) и нанотелами (B).Для обоих подходов к иммуноокрашиванию временные каналы Tb (TG Tb PL) и QD (TG QD PL) выявляют яркие сигналы PL, происходящие в основном от клеточных мембран. ( C и D ) Напротив, окрашивание только QD-антителами (C) или только Tb-антителами (D) не приводит к TG PL в канале QD (TG QD PL, справа), а только становится видимой чистая ФЛ КТ SS (C, ФЛ SS QD, слева) или чистая ФЛ TG Tb (D, слева). Длины волн возбуждения и излучения для различных каналов детектирования были следующими: λ _ex = 365 нм и λ _em = 494 ± 10 нм для TG Tb PL, λ _ex = 365 нм и λ _em = 655 ± 20 нм для ФЛ КТ TG и λ _ex = 545 ± 15 нм и λ _em = 610 ± 35 нм для ФЛ КТ SS. Для изображений ТГ число интеграций составило 220 и 110 для каналов ТГ Тб ФЛ и ТГ КТ ФЛ соответственно. Изображения канала Tb-QD FRET (TG QD PL) были скорректированы для спектральных перекрестных помех, и каждое изображение канала TG QD PL на этом рисунке представлено с одинаковым контрастом. Шкала баров, 20 мкм.

Внутриклеточный FRET Tb-QD в цитозоле с использованием микроинъекции

Большая разница во времени жизни возбужденного состояния донора Tb (миллисекунды) и акцептора КТ (наносекунды) позволяет многократное последовательное FRET-возбуждение одной КТ несколькими донорами Tb ( 11 ).Эффективная яркость или скорость испускания фотонов увеличивается вместе с количеством доноров Tb, связанных с поверхностью, таким образом, который не зависит от эффективности FRET и светового потока возбуждения (при условии, что интенсивность света достаточно высока, чтобы возбудить несколько доноров Tb одновременно). ). Такое усиление яркости также наблюдалось в иммуноанализах Tb-to-QD FRET в фазе раствора ( 28 ). Чтобы продемонстрировать это увеличение яркости FRET-сенсибилизированных КТ в контексте визуализации, мы прикрепили Tb-pep посредством гексагистидиновой (His ₆ ) опосредованной самосборки при контролируемых валентностях ( x Tb на КТ) к поверхности, богатой цинком. излучающих КТ с длиной волны 625 нм (QD625), функционализированных компактными лигандами CL4 ( 36 ).КТ, приготовленные таким образом, уже доказали свою устойчивость и устойчивость к сложным клеточным средам ( 37 , 38 ). Наносборки Tb _x -QD (0,5 мкМ) затем микроинъецировали в цитоплазму живых клеток HeLa. SS QD PL и TG Tb и QD PL были хорошо видны и распространялись по всей цитоплазме (рис. 3А). Сигнал TG Tb PL, наблюдаемый в ядре (рис. 3A, в центре), можно объяснить наличием свободного пептида Tb, который достаточно мал, чтобы диффундировать через ядерные поры.Мы наблюдали увеличение отношения сигналов TG Tb-to-QD FRET к SS QD PL с увеличением x (рис. 3B), что демонстрирует упомянутый выше эффект усиления яркости. Аналогичная тенденция наблюдалась при увеличении концентрации КТ в инъекционном растворе до 0,9 мкМ (рис. S2). При валентности Tb/QD ок. 25, увеличение отношения FRET начало выравниваться, указывая на начало насыщения поверхности КТ. Для валентностей x ≥ 40 преципитация происходила при обеих концентрациях КТ.Мы связываем это с недостатком гидрофильных остатков в пептиде, а также с природой самого комплекса Tb, которые кумулятивно дестабилизируют коллоидную стабильность КТ при высоких локальных концентрациях.

Рис. 3 Внутриклеточное отношение Tb к КТ увеличивается с увеличением Tb на валентность КТ.

( A ) PL-изображения, показывающие клетки после инъекции раствора Tb ₁₅ -QD (концентрация QD, 0,5 мкМ). Длины волн возбуждения и излучения для различных каналов детектирования были следующими: λ _ex = 545 ± 15 нм и λ _em = 610 ± 35 нм для SS QD (SS QD PL), λ _ex = 365 нм и λ _em = 494 ± 10 нм для TG Tb (TG Tb PL), и λ _ex = 365 нм и λ _em = 605 ± 8 нм для TG Tb-to-QD FRET (TG QD PL). Для ТГ-изображений количество интеграций составляло 660. Изображения канала ТГ КТ ФЛ были скорректированы на спектральные перекрестные помехи. Масштабная линейка, 20 мкм. ( B ) Отношение спектрального сигнала ФЛ КТ TG с поправкой на перекрестные помехи к сигналу ФЛ КТ SS, построенное как функция молярного соотношения Tb на КТ в инъекционном растворе. Отношение FRET явно увеличивается с увеличением количества Tb на поверхности КТ, что указывает на сенсибилизацию QD-FRET несколькими Tbs. Интенсивности PL каналов TG и SS QD были взяты из нескольких областей интереса (ROI) из ≥10 клеток в каждом состоянии.Планки погрешностей, SEM.

Еще один важный аспект для широкой применимости Ln-QD FRET касается общего количества сборок Tb _x -QD, которые были визуализированы в цитоплазме живых клеток. Чтобы проанализировать это, мы использовали недавно разработанный метод, в котором мы откалибровали наш ТГ-микроскоп, чтобы связать значение серого пикселя при заданном наборе условий освещения с абсолютной концентрацией молекул Tb в цитоплазме ( 39 ). Путем введения растворов туберкулёза с различной концентрацией в клетки HeLa и применения ранее определённой калибровочной кривой система микроинъекций была откалибрована таким образом, чтобы можно было оценить концентрацию растворенного вещества в цитоплазме по концентрации растворенного вещества в инъекционном растворе (рис.С3). Результаты этой калибровки показали, что концентрация растворенного вещества в цитоплазме составляла около 2% от концентрации в инъекционном растворе. Принимая во внимание концентрацию раствора для инъекций 0,5 мкМ, мы смогли обнаружить сигналы FRET от Tb к КТ, когда цитоплазматическая концентрация сборок Tb-КТ составляла всего 10 нМ (около 10 ⁴ копий на клетку) с пониженной валентностью. до 5 Tb (50 нМ) на КТ (рис. 3B), и сборки Tb ₁₅ -QD можно было легко визуализировать на этом уровне (рис.3А). Для сравнения, предельная концентрация для микроскопического обнаружения флуоресценции зеленого флуоресцентного белка в цитоплазме составляет около 200 нМ ( 40 ), и мы ранее установили низкий микромолярный предел для ТГ обнаружения цитоплазматического туберкулеза с использованием той же установки визуализации ( 39 ). ). Представленные здесь результаты ясно показывают, что большая разница во времени жизни в возбужденном состоянии доноров Tb и акцепторов КТ может быть использована для эффективного усиления сигналов FRET, опосредованных Tb, что приводит к 100-кратному увеличению чувствительности обнаружения TG.Такие системы FRET Tb-QD уже использовались для мультиплексного определения активности микроРНК ( 30 ), ДНК ( 27 ) и активности протеазы ( 41 ). Таким образом, демонстрация яркого внутриклеточного FRET Tb-to-QD является очень важным шагом на пути к применению этой пары FRET для исследования кинетики нуклеиновых кислот и ферментов внутри клеток.

Внутриклеточные FRET-переключатели Tb-QD-красителя в цитозоле с помощью микроинъекции — и пептиды, меченные акцептором красителя (AF), для наблюдения FRET Tb-to-QD-to-AF в живых клетках.Краситель AF был выбран спектрально, чтобы быть подходящим акцептором ниже по течению для КТ. QD625 (2 мкМ) инкубировали с 20-кратным молярным избытком Tb-pep (40 мкМ) в течение примерно 1 часа, после чего добавляли пептиды AF в различных концентрациях от 5 до 20 мкМ (где

y — количество AF на QD). Сборки Tb ₂₀ -QD-AF _y вводили в клетки HeLa и визуализировали в режимах SS и TG. Как показано на рис. 4, сигналы ФЛ как TG Tb, так и QD (Tb-to-QD FRET) четко наблюдались для всех комбинаций Tb ₂₀ -QD-AF _y , тогда как TG AF (Tb-to-QD FRET) QD-to-AF FRET) PL проявлялась только в сборках, содержащих AF ( y ≥ 5).Количественный анализ (рис. 4Б) показал, что увеличение валентности AF на КТ (при фиксированной валентности Tb x = 20) приводило к слабому уменьшению отношения ФЛ КТ TG к ФЛ КТ SS (поскольку ФЛ КТ TG ФЛ снижается несколько сильнее, чем ФЛ SS QD) и сильное увеличение отношения TG AF PL к SS QD PL. Это значительное увеличение интенсивности предоставило еще одно убедительное доказательство того, что энергия передается от Tb к AF через QD и о функциональности реле FRET, опосредованного QD. Следует отметить, что прямое FRET Tb-AF нельзя исключать, поскольку ФЛ Tb и поглощение AF показывают некоторое соответствующее спектральное перекрытие. Однако, как показано для той же системы, примененной к анализам in vitro ( 27 ), значительные различия в расстояниях Фёрстера [ R ₀ (Tb-QD) = 10,1 нм, R ₀ ( QD-to-AF) = 7,5 нм и R ₀ (Tb-to-AF) = 5,7 нм] делают Tb-to-AF FRET в 30 и 5 раз медленнее, чем Tb-to-QD и QD -к-AF FRET соответственно. Следовательно, прямой FRET Tb-AF внесет лишь незначительный вклад в полную релейную систему FRET. Возможность TG-визуализации реле FRET Tb-QD-to-dye представляет собой важное доказательство принципа использования этих многоэтапных систем FRET для внутриклеточных биосенсорных приложений, таких как мультиплексный анализ кинетики ферментов ( 41 ), гибридизация ДНК. ( 27 ) или устройства молекулярной логики ( 42 , 43 ).

Рис. 4 Внутриклеточные реле Tb-to-QD FRET и Tb-to-QD-to-dye FRET после микроинъекции в живые клетки HeLa.

( A ) PL-изображения, показывающие клетки после инъекции Tb ₂₀ -QD-AF _y наноансамблей с валентностями AF ( y ) от 0, 12,5 или 20 (сверху вниз). Длины волн возбуждения и излучения для различных каналов детектирования были следующими: λ _ex = 545 ± 15 нм и λ _em = 605 ± 8 нм для SS QD (SS QD PL), λ _ex = 365 нм и λ _em = 494 ± 10 нм для TG Tb (TG Tb PL), λ _ex = 365 нм и λ _em = 605 ± 8 нм для TG Tb-to-QD FRET (TG QD PL), и λ _ex = 365 нм и λ _em = 710 ± 20 нм для TG Tb-to-QD-to-AF FRET (TG AF PL).Для ТГ-изображений количество интеграций составляло 660. Изображения канала ТГ КТ ФЛ были скорректированы на спектральные перекрестные помехи. Шкала баров, 20 мкм. ( B ) Отношение сигнала TG QD PL с поправкой на спектральные перекрестные помехи к сигналу SS QD PL (вверху) и сигнала TG AF PL к сигналу SS QD PL (внизу) в зависимости от молярного соотношения AF на КТ в инъекционном растворе. Отношение ФЛ КТ ТГ к ФЛ КТ СС несколько уменьшается с увеличением количества АФ на поверхности КТ, тогда как отношение ФЛ КТ АФ ТГ к ФЛ КТ СС существенно увеличивается. Это указывает на FRET от Tb к AF, передаваемый центральной QD. Интенсивность PL каналов Tb-to-QD FRET, Tb-to-QD-to-AF FRET и QD были взяты из нескольких ROI ≥10 клеток для каждого состояния. Планки погрешностей, SEM.

Внутриклеточный FRET Tb-to-QD в эндосомах/лизосомах с использованием CPP-опосредованного эндоцитоза в данном случае поверхность функционализирована лигандом полиэтиленгликоль (ПЭГ)-метокси (

36 , 44 ).Клеточная доставка КТ посредством CPP-опосредованного эндоцитоза была продемонстрирована ранее много раз (, 45, , , 46, ), и было показано, что этот конкретный CPP (R9GGLAAibSGWKH6) доставляет КТ в основном в эндосомы, а затем и в лизосомы (, 47, ). . Хорошо известно, что в эукариотических клетках эндосомы обычно подвергаются конститутивному закислению по мере их созревания со временем (-48-). Это, в свою очередь, потенциально может влиять на эмиссионные и FRET-свойства флуорофоров, расположенных внутри эндосом (, 49, ). Действительно, рН-чувствительные флуоресцентные красители используются для сенсорных целей в этих и подобных сценариях. Есть также примеры использования для этих целей pH-чувствительных КТ, хотя они состоят из ядер CdTe без защитной оболочки ( 50 ). Такая чувствительность также может оказывать заметное влияние на эффективность FRET за счет изменения фотофизических свойств донорно-акцепторных материалов. Принимая во внимание эти моменты, важно отметить, что материалы QD вместе с красителем AF, который мы использовали, стабильны и не подвержены ожидаемому диапазону изменений pH, встречающихся здесь ( 36 , 51 ).Аналогичным образом внутриклеточная целостность Tb внутри хелата Tb также может быть потенциальной проблемой ( 52 ). Однако структура лиганда изофталамидного типа, который хелатирует ион Tb, предназначена для удержания атома с очень высоким сродством ( 53 ). Учитывая это, в сочетании с отсутствием каких-либо наблюдаемых значительных изменений в эффективности FRET за время экспериментов, мы заключаем, что внутриклеточный pH и молекулярная деградация не являются здесь актуальными проблемами. Чтобы сначала протестировать различные условия поглощения, мы сравнили различные концентрации инкубации КТ и валентности CPP на КТ перед добавлением Tb-pep. При фиксированной валентности 25 СРР на КТ эндоцитоз можно было четко наблюдать при концентрациях КТ 25 и 100 нМ, тогда как те же концентрации КТ без СРР не приводили к какому-либо значительному клеточному поглощению (рис. S4). Поскольку отношения сигнал-шум были одинаковыми для обеих концентраций, мы решили работать с более низкой концентрацией 25 нМ для тестирования различных валентностей CPP на КТ.Изображения PL не показали видимого клеточного поглощения для валентностей ≤10, но 15 и 25 CPPs на КТ приводили к четко различимому эндоцитозу КТ с типичными остроконечными пятнами PL внутри клеток, что указывает на то, что КТ в основном остаются в эндосомах или лизосомах (рис. S5) и не высвобождаются или частично высвобождаются в цитозоль. Хотя 15 CPP на КТ уже обеспечивали достаточное отношение сигнал/шум для визуализации, оно могло быть более чем удвоено для 25 CPP при тех же условиях визуализации, показывая, что клеточное поглощение было более чем в два раза эффективнее при использовании 25 вместо 15. CPP.Поэтому мы решили использовать фиксированную валентность 25 СРР на КТ для следующих экспериментов по совместной сборке СРР и Tb-pep на одних и тех же КТ. Tb-pep при 12,5-, 25-, 35- и 45-кратном увеличении концентрации КТ инкубировали с сборками CPP ₂₅ -QD, и ТГ-изображения регистрировали как в канале Tb, так и в канале КТ (рис. 5). Образец QD625 имеет твердый диаметр ~ 9,3 нм, что предполагает, что он должен быть в состоянии разместить на поверхности около 60 пептидов; однако это не позволяет предсказать их влияние на коллоидную стабильность ( 54 , 55 ).Для наносборки CPP ₂₅ -QD-Tb _12.5 ни в канале Tb, ни в канале КТ не удалось обнаружить специфического сигнала ТГ ФЛ, который был бы легко различим на фоне фонового шума. При валентностях ≥25 внутриклеточная ФЛ, возникающая в результате ФЛ Tb и Tb-сенсибилизированной ФЛ QD, становилась ясно видимой. Для всех трех систем сигналы FRET от Tb к КТ ярче, чем сигналы донора Tb, что подтверждает эффект повышения яркости, вызванный FRET от нескольких Tb к КТ (см. выше).Для сборки CPP ₂₅ -QD-Tb ₂₅ внутриклеточное мечение оказывается наиболее однородным (в частности, в канале Tb-to-QD FRET), тогда как внутриклеточное осаждение происходит при более высоких валентностях Tb. Это подтверждает эксперименты с микроинъекциями, в которых преципитация была обнаружена при высоких соотношениях пептидов на КТ (см. выше). Другой интересный результат касается изображений в канале Tb. При валентности 25 Tb на КТ FRET к КТ очень эффективен, а ФЛ TG QD ярче, чем FRET-тушенная ФЛ Tb, которая лишь немного интенсивнее фона.При 35 Tb на QD PL Tb-to-QD FRET PL по-прежнему очень яркий; однако ФЛ Tb также стала значительно сильнее фоновой ФЛ, что подтверждает эффект насыщения, обнаруженный в экспериментах с микроинъекциями (рис. 3Б). При еще более высоких валентностях (45 Tb на КТ) фон ФЛ в канале Tb становится значительно сильнее, и это особенно заметно вне клеток. При этой валентности общее количество пептидов 60 (25 CPP и 35 Tb-pep) было смешано с КТ, и поэтому мы приписываем это фоновое увеличение некоторым свободным Tb-pep, которые не могли эффективно связываться с уже насыщенными поверхностями КТ.

Рис. 5 Внутриклеточный FRET Tb-to-QD после CPP-опосредованного эндоцитоза.

ТГ-изображения различных CPP ₂₅ -QD-Tb _x Комплексы FRET (с x = 12,5, 25 или 35 сверху вниз), интернализованные в клетках HeLa. Все образцы возбуждались импульсным (100 Гц) лазером на длине волны 349 нм. Сигналы были собраны с 60-кратным объективом [UPLSAPO, числовая апертура (NA) = 1,35]. Длины волн излучения для различных каналов детектирования составляли λ _em = 542 ± 20 нм для TG Tb PL и λ _em = 620 ± 14 нм для TG Tb-to-QD FRET (TG QD PL).Изображения были получены с помощью камеры устройства с усиленной зарядовой связью (ICCD), а параметры стробирования были зафиксированы на уровне 10 мкс для задержки стробирования, 2,5 мс для ширины стробирования и 400 стробов за экспозицию. Шкала баров, 20 мкм.

Принимая во внимание предыдущие эксперименты по совместной сборке и зависимости от концентрации, а также результаты микроинъекций, мы провели дальнейшие эксперименты по внутриклеточной визуализации TG FRET CPP-QD-Tb на большем количестве клеток, с концентрациями QD 50 нМ и валентностями CPP. ₂₀ -QD-Tb ₂₀ (рис.6) и CPP ₄₀ -QD-Tb ₄₀ (рис. S6). Обе наносборки показали очевидное клеточное поглощение как на изображениях TG Tb и QD, так и на изображениях SS QD PL. Однако системы CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ обеспечивают гораздо более яркие и четкие изображения с меньшим фоном, как уже было обнаружено в вышеупомянутых экспериментах. Количественный анализ интенсивности PL с использованием многих ROI от ≥20 клеток для каждой из двух разных нанокомплектов FRET и контрольной установки, в которой клетки окрашивались только Tb, чтобы учесть спектральные перекрестные помехи PL Tb внутри FRET Tb-QD. канала, подчеркнули, что обе системы CPP-QD-Tb демонстрируют значительный внутриклеточный FRET.На рисунке 6B показаны средние отношения FRET канала Tb к QD FRET к каналу Tb (фоновый сигнал от бесклеточных областей был вычтен из сигналов ROI внутри клеток для обоих каналов). Результаты подтверждают значительно более высокую яркость системы CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ FRET, которая примерно в 2,5 раза больше по сравнению со сборкой CPP ₄₀ -QD-Tb ₄₀ . Большая стандартная ошибка в случае менее валентной системы, скорее всего, связана с более неоднородным распределением пептидов на поверхности КТ и большим коэффициентом FRET.Для 40 пептидов поверхность КТ еще не насыщена, и ожидается, что валентность будет около 40 ± 12 пептидов. При инкубации с 80 пептидами поверхность КТ насыщается пептидами, а все свободные пептиды и агрегированные наносборки вымываются и не вносят вклада в сигнал. Остальные наноансамбли CPP-QD-Tb менее интенсивны, чем в случае системы CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ (более низкий коэффициент FRET), но также имеют менее гетерогенное распределение пептидов, близкое к максимальной нагрузочной способности, что ожидается около 50 ± 5 пептидов (ср.Рис. 3Б). Демонстрация клеточного поглощения наносборок Tb-QD FRET совместно собранными CPP является важным шагом на пути к применению этой системы FRET для внутриклеточного биосенсора FRET, который не может использовать микроинъекцию отдельных клеток. CPP-функционализированные КТ уже использовались для эндоцитозного захвата и последующей доставки в цитозоль с минимальными цитотоксическими эффектами (, 56, ) и для визуализации расширения спинного мозга в различные клеточные системы в развивающемся мозге птиц (, 38, ). Система Tb-QD FRET может расширить этот инструмент внутриклеточной визуализации до еще более универсальных сенсорных приложений.

Рис. 6 Влияние различных CPP и Tb на валентность КТ.

( A ) ФЛ-изображения CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ наноансамблей, интернированных в клетки HeLa. Длины волн возбуждения и излучения для различных каналов детектирования были следующими: λ _ex = 349 нм и λ _em = 542 ± 20 нм для TG Tb [(A1) TG Tb PL], λ _ex = 349 нм и λ _em = 605 ± 15 нм для TG Tb-to-QD FRET [(A2) TG QD PL], и λ _ex = 494 ± 20 нм и λ _em = 605 ± 15 нм для SS КТ [ (A3) СС КД PL].Сигналы собирали с помощью объектива 60× (Uplsapo, числовая апертура = 1,35). Изображения SS QD были получены с помощью камеры с комплементарным металл-оксид-полупроводник (CMOS) (время сбора данных 5 мс), а изображения TG Tb PL и TG QD PL были получены с помощью камеры ICCD (параметры стробирования были зафиксированы на уровне 10 мкс для затвора). задержка, 2,5 мс для ширины строба и 800 строб на экспозицию). Шкала баров, 20 мкм. ( B ) Отношения FRET (интенсивность каналов TG QD PL к каналам TG Tb PL, взятые из нескольких ROI ≥20 клеток для каждой системы) чистого Tb, CPP ₄₀ -QD-Tb ₄₀ и CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ наносборки.Планки погрешностей, SEM.

В заключение, мы разработали несколько систем FRET TG Tb-to-QD, которые можно использовать для внутри- и внеклеточной FRET-визуализации с очень эффективным подавлением аутофлуоресценции образца и акцепторной флуоресценции благодаря прямому возбуждению, что устраняет необходимость в отдельном получении чистые акцепторные и чистые донорные PL-изображения, необходимые для обычных экспериментов по визуализации FRET. Мы продемонстрировали, что FRET Tb-QD можно использовать для внеклеточного распознавания мембранного рецептора EGFR с помощью конъюгатов Tb- и QD-антитело, которые распознают различные эпитопы EGFR.Применение коммерческих терапевтических антител (цетуксимаб и матузумаб) и однодоменных антител V _H H (нанотел) для успешного обнаружения FRET EGFR на живых клетках A431 показало широкую применимость пары FRET Tb-QD для иммуноокрашивания на основе флуоресцентная визуализация. Для демонстрации внутриклеточных реле FRET Tb-QD и Tb-QD-to-dye FRET мы использовали наносборки Tb-QD-красителя (Tb-pep и пептиды-красители, самособирающиеся через His ₆ в поверхности КТ), которые были микроинъецированы в живые клетки HeLa.Наши эксперименты показали очень эффективную FRET и многоступенчатую FRET внутри цитозоля и повышение яркости FRET из-за FRET от нескольких Tbs к одной и той же квантовой точке. Это, безусловно, служит хорошим предзнаменованием для будущих приложений, которые стремятся применить те же материалы к конфигурациям активных датчиков. Более того, мы продемонстрировали, что возможна клеточная доставка Tb-QD через CPP (совмещенные через His ₆ с QD), что привело к эффективному FRET Tb-QD (в основном внутри эндосом/лизосом клеток HeLa) снова с FRET повышение яркости для CPP ₂₀ -QD-Tb ₂₀ наносборок.Большая универсальность одно- и многоступенчатой ​​внутри- и внеклеточной FRET в сочетании с ранее показанной возможностью мультиплексирования высокого порядка с системами FRET на основе Tb-QD ( 11 ) сделают FRET Tb-QD очень мощный инструмент для широко применимой внутри- и внеклеточной флуоресцентной визуализации и зондирования.

Как читать вкладку Bass

Басовая табулатура , или басовая табулатура , представляет собой довольно простую систему нотной записи для баса. Вы найдете его в музыкальных книгах, журналах по басу и во всем Интернете.

ВАЖНО: Обучение игре на басу табулатурой и песнями — это лишь малая часть того, что значит учиться играть на басу. Если вы еще этого не сделали, обязательно прочитайте мою статью об ошибках начинающих басистов в разделе «Основы игры на басу».

О том, как читать басовые табулатуры…

Струны в басовой табуляции

Вкладка Bass показывает струны баса, нарисованные горизонтально. Чаще всего басовая табуляция пишется для 4-струнного баса, но вы можете встретить ее и для 5-струнного и 6-струнного баса.Это будет зависеть от того, требуется ли больше струн для воспроизведения песни.

Басовые струны натянуты так, что струна с самым низким тоном (самая толстая) находится внизу. Стандартная настройка баса от самого низкого к самому высокому — E-A-D-G и выглядит так:

.

Г —————————————————-
Д —————————————————-
А ————————————-
Е —————————————————-

Для некоторых музыкальных произведений требуется другой строй или большее количество струн, но перспектива остается неизменной, самая низкая (самая толстая) струна находится внизу.

Номера ладов в басовой табуляции

Во вкладке Bass ноты обозначаются номером лада. Номер лада написан на струне, на которой он играет. Большинство басов имеют от 20 до 24 ладов. Вы можете увидеть номера ладов от 0 (открытая струна) до 24.

В этом примере вы должны играть на 3-м ладу струны ми, затем на 2-м ладу струны ля, затем на 5-м ладу струны ля, и, наконец, на 5-м ладу струны ре, затем обратно. вниз по тем же нотам.

Г ————————————
Д ———- ———————-5—
А ———2—-5——— -5—-2——-
E —3—————3 —

 Вышеприведенное может выглядеть и звучать так (нажмите кнопку воспроизведения, чтобы увидеть и услышать анимированный гриф):

Бары в басовой вкладке

Стержни обычно отмечаются вертикальной штриховой чертой в соответствии со стандартными обозначениями.

Г ———————|—
Д ——— ————————|—
А ——————-| ——————
E ——————-| ———— ——

Такты сообщают вам, когда начинается отсчет: 1, 2, 3, 4 [тактовая черта] 1, 2, 3, 4, [тактовая черта]…

Ритм в басовой табуляции

Во многих случаях ритм не отображается на вкладке баса. Все, что вы получаете, это порядок нот. В этом случае вам предоставляется возможность самостоятельно прослушать запись и собрать ее воедино.

В других случаях ритм отмечен внизу, а количество записано под номерами ладов.

В этом примере табулатуры для баса внизу записана восьмая нота…

G ————-
D ————— 5— -|———
A ——-2—5———|———
E —3—- ————|———
     1 + 2 + 3 + 4 +

Другая маркировка бас-гитары

Многие другие маркировки на басовых вкладках указывают, как следует играть ноты. ) указывает на изгиб.

Знак X (x) указывает на заметку-призрак.

Буква H (h) указывает на удар молотком.

A P (p) обозначает отрыв.

Для маркировки под струнами:

• S обозначает шлепок большим пальцем.
• A P указывает на щелчок.
• A T указывает на отвод. Часто используемая рука помечается буквами L или R и предполагает, что вы правша.

Измененные настройки баса

Еще одна вещь, с которой вы столкнетесь в басовых табулатурах, — это альтернативные настройки.В верхней части вкладки может быть указано изменить настройку вашего баса на что-то нестандартное (EADG). На вкладке может быть указан точный строй, например, Db-Ab-Db-Gb, или использоваться общее название строя, например «Drop D» (что означает DADG). Он всегда пишется от нижнего ряда к верхнему.

Вы можете узнать больше о стандартных настройках баса и альтернативных настройках баса на StudyBass.

Как читать сводку табуляции Bass

Читать басовую вкладку не так уж и много. Это просто номера ладов на линиях струн.Табуляция для баса может стать настоящим подспорьем для начинающих, пока они еще не научились читать стандартную нотную запись или не выучили названия нот на грифе. Кроме того, может быть полезно показать сложные аппликатуры наряду со стандартной нотной записью. Вы должны быть хотя бы знакомы с басовой табулатурой.

Рекомендуемые вкладки для баса

Если вы ищете хорошие табулатуры для игры на басу, ознакомьтесь с моим разделом рекомендаций по книгам по табулатурам для баса. Я использую песни из этих книг в качестве теории и примеров игры на своих уроках игры на басу.

Удачи, и я надеюсь, что вы изучите остальную часть StudyBass!

.