Гранта лада какой клиренс: 5 лучших легковушек (до 700 000 руб.) для плохих дорог — журнал За рулем

Содержание

Лада Гранта лифтбек: клиренс и показатели проходимости

На стадии разработки дизайна новой модели было понятно, что мир увидит Лада Гранта лифтбек, клиренс которой адаптирован к нашим дорогам. Получился автомобиль, задняя дверь которого открывается вверх вместе с окном и который имеет форму седана (имитация формы небольшого багажника). Новый ВАЗ с таким кузовом сошел с конвейера завода в мае 2015 года и сразу заинтересовал как автомобильных специалистов, так и любителей отечественного автостроения.

Проектирование машины в новом кузове начали практически параллельно с созданием базового седана. Разница по времени составила около полугода между тем, когда начали создавать экстерьер для лифтбека. Начинал это еще англичанин, вице-президент дизайн-центра Renault на Волжском автозаводе. Машину в кузове седан Э. Грейд успел закончить, но лифтбек довели до ума уже другие специалисты, которые уделили достаточно внимания дорожному просвету и проходимости автомобиля. Из-за выхода в свет второго поколения калины этот успешный проект отложили в порядке очереди.

Особенности изменений кузова Лада Гранта лифтбек

Кроме изменения наружных деталей был проведен серьезный комплекс мероприятий по улучшению жесткости конструкции кузова, так как конструктивно в машине нет поперечины на задних стойках. В конструкцию добавлены дополнительные усиления в виде раскосов и растяжек, которые наблюдаются в багажнике. Выросла толщина средних лонжеронов, которая вместо 1,5 мм достигла 1,8 мм, также поставили лист пола толщиной в 1,2 мм. В итоге автомобиль стал жестче по сравнению с хэтчбеком, а это позволило поработать над клиренсом. Жесткость позволила поднять машину выше без существенных потерь в управляемости и устойчивости. Такие изменения на испытаниях ВАЗ дали лучший результат при движении по булыжнику, брусчатке и другим малоприспособленным дорогами.

На ВАЗе подтянули передний бампер, который не цепляет бордюры или края выбоин на дороге и выглядит органично и современно. Приятной мелочью справедливо можно считать новые зеркала со встроенными указателями поворота, которые претерпели ряд конструктивных изменений и больше не шумят на высоких скоростях.

Помимо внушительного дорожного просвета и хорошей проходимости новый ВАЗ получил идеальную форму перехода линии крыши к багажнику, совмещенную с восходящей к корме подоконной линией. Такие решения направлены на эстетическую красоту автомобиля, которая призвана обострить интерес автолюбителей к новому детищу ВАЗ.

Если коснуться интерьера Гранты, то не стоит искать кардинальных отличий от базы. Это вызвано унификацией моделей и, как следствие, снижением стоимости транспортного средства. В салоне тот же недорогой пластик, мультимедийный комплекс, стандартные и не очень удобные подстаканники, «размашистый» переключатель передач механической КПП, своеобразная посадка водителя.

Отсутствует указатель температуры силового агрегата, слегка ограничен обзор заднего стекла в нижней части. Хотя достоинств у Лада Гранта лифтбек достаточно, многие из них заимствованы у седана, но подросший и удобный багажник совместно с повышенным клиренсом выгодно отличают от старшего брата.

Дорожный просвет Лада Гранта

Клиренс автомобиля — это расстояние от ровной поверхности, на которой размещено транспортное средство, до его нижнего габарита по центральной линии. Большой дорожный просвет обеспечивает лучшую проходимость машины, но снижает устойчивость на шоссе. Для того чтобы разобраться, какой реальный дорожный просвет у Лада Гранта лифтбек и какие возможности он обеспечивает, следует проверить клиренс при разных внешних факторах и нагрузках, а также сравнить с седаном.

В руководстве по эксплуатации Гранты седан указаны технические характеристики, значения которых одинаковы для любой комплектации:

  • клиренс при полной нагрузке под картером двигателя не менее 160 мм для машин с механической коробкой и 156 мм для версии с автоматической КПП.
  • дорожный просвет при полной нагрузке под картером коробки передач не менее 160 мм для механики, но существенно меньше для автомата — 145 мм.

Клиренс Лады лифтбек, согласно заявленным производителем значениям, немного отличается от седана:

  • дорожный просвет при полной нагрузке под картером двигателя не менее 160 мм, для версии люкс с ВАЗ-21126 и АКПП — 135 мм.
  • дорожный просвет при полной нагрузке под картером коробки передач у лифтбека не менее 167 мм (версии стандарт и люкс с двигателем 11186), 180 мм (норма и люкс с мотором 21127), 160 мм (норма, оснащенная силовой установкой 21116), 169 мм (норма и люкс с ВАЗ-21126).

Учитывая, что полная масса машины больше, чем снаряженная, на 400 кг и чаще всего автомобиль не будет нагружен этим весом, дорожный просвет ВАЗ с новым кузовом будет намного выше заявленных производителем. На практике расстояние от поверхности дорожного покрытия до защиты двигателя достигает 200 мм при снаряженном автомобиле и с двумя пассажирами в салоне, при этом высота переднего бампера — 250 мм. Подобные характеристики у следующего представителя семейства ВАЗ — Калины 2 поколения.

Что дают большой дорожный просвет и проходимость лифтбека

Небольшие скаты переднего и заднего бамперов и высокий клиренс обеспечивают автомобилю Лада Гранта в кузове лифтбек:

  • высокую проходимость;
  • устойчивость на высоких скоростях;
  • уверенность при парковке;
  • сохранность днища машины;
  • хорошую аэродинамику нижней части авто.

Такими качествами проходимости обладает не каждый кроссовер. На новом автомобиле ВАЗ можно спокойно съехать на проселочные дороги и в тихие места в поисках красивых пейзажей. Подвеска энергоемкая и отлично ведет себя на ухабах и кочках, машина хорошо преодолевает пересеченную местность, некоторые задержки могут вызывать разве что обычные дорожные шины, которые срываются в пробуксовку на траве. Хорошо зарекомендовали себя легкий руль и маневренность автомобиля. Управление при движении по трассе достаточно информативно. Хороший клиренс позволяет не беспокоиться при движении в городских условиях, даже большие ямы на дороге не приводят к ударам о днище. Практически отсутствует риск задеть бордюр на парковках, передний и задний бамперы достаточно подняты. Внушительный клиренс ВАЗ не снизил устойчивости и управляемости автомобилем.

Конечно, у Лады Гранта лифтбек некоторые моменты нужно дорабатывать. Багажник объемный и просторный, обладает отличным доступом, но закрытие задней двери не совсем удобное.

Также нельзя перевозить габаритные вещи в багажном отсеке, что вызвано выступающими усилителями кузова, которые сделаны для жесткости конструкции, позволившей повысить клиренс. Высокий задний бампер машины наделен еще одной функцией, которая совместно с аэродинамикой обводов кузова обеспечивает снижение уровня загрязнения заднего стекла машины благодаря распределению завихрений воздуха за авто. Хороший дорожный просвет и стремительные черты кузова придают Ладе Гранта лифтбек привлекательную внешность, особенно в профиль.

Конструкторам ВАЗ удалось сделать легковой автомобиль с таким кузовом и небольшими размерами гармоничным. Новый ВАЗ привлекает автовладельцев одновременно красивым и вместительным кузовом, отсутствием тяжеловесности. Благодаря хорошему клиренсу и малым скатам бамперов автомобиль имеет легкий и привлекательный силуэт.

Рейтинг статьи:

Загрузка. ..

Поделиться в соцсетях:

Клиренс Lada Granta с «автоматом» ниже, чем с «механикой»

Самая бюджетная модель АвтоВАЗа стала самым первым отечественным легковым автомобилем массового потребления с серийно устанавливаемой автоматической коробкой передач. В 2012 году седан Lada Granta получил японский 4-ступенчатый «автомат» фирмы Jatco, который также используется на некоторых моделях Nissan. Данный агрегат является классической АКПП с гидротрансформатором, то есть, продукт не самых передовых технологий, но именно такой вариант лучше всего подошел вазовской модели, не требуя серьезный конструктивных изменений.

Тем не менее, чтобы приспособить вазовский седан под японский «автомат», специалистам АвтоВАЗа и Jatco пришлось несколько поработать над настройкой и калибровкой агрегатов, дабы наладить взаимодействие двигателя и коробки. В качестве силового агрегата для «Гранты» с «автоматом» был выбран «приоровский» 16-клапанный мотор мощностью 98 л.

с. — его силы должно хватить для вполне сносной динамики. Из конструктивных новинок следует отметить установку более производительного радиатора охлаждения, куда конструктивно вписали и маслоохладитель.


Поскольку сама конструкция «двигатель-коробка» потяжелела на целых 33 кг, потребовалось приспособить новые более жесткие пружины в передней подвеске. Чтобы повысить жесткость конструкции, двигатель снабдили литым картером вместо штампованного и приделали поддону новые точки крепления – напрямую к гидротрансформатору, картер которого также заменили, дабы вписать его в подкапотное пространство «Гранты». Следствием такой деятельности стало заметное снижение клиренса до 140 мм против 160 мм у обычной версии с «механикой». И пусть такое снижение дорожного просвета кажется непривычно низким для отечественной модели, все же Lada Granta с автоматической трансмиссией рассчитана прежде всего на жителей крупных городов, где удобство передвижения в «рваных» пробочных режимах намного важнее проходимых способностей автомобиля.

Лада-Гранта: клиренс. Лада-Гранта: характеристики автомобиля

В начале осени 2018 года миру на московском автосалоне на подиуме была представлена новая отечественная машина марки Lada — это Granta. Нынче, на начало 2019 года, эта машина достаточно популярная, и ее любят граждане Российской Федерации. По своей сути, это рестайлинг старой модели, однако из-за того что были введены новшества, использованы технологии, ее назвали новым поколением.

Хотя чего-то особенного и нового, чтобы назвать ее действительно совсем другой, не обнаружилось. В этой статье мы разберемся, в чем отличия этого поколения от старого, а также узнаем размеры «Лады-Гранты», ее технические характеристики и многое другое. Основывать информацию будем на материале отзывов владельцев, а также официальной статистике, которую составляют профессионалы. В статье будут представлены действительно самые важные и существенные факты, которые помогут вам разобраться в новшествах этого авто.

Отличия

Самым существенным, конечно же, явилось то, что добавили во второе поколение несколько новых типов кузова. Теперь это не только седан и лифтбек, но еще и хэтчбек и универсал. Ранее, до 2018 года, такой тип кузова имела исключительно Lada Kalina. Теперь стиль и дизайн машины стал полностью такой, как у этой модели, однако, название будет уже именно Granta. Сделано это скорее всего для того, чтобы расширить линейку флагманского автомобиля. Также это поможет Lada Granta стать более популярной.

Дизайнерские отличия

Да, разница с первым поколением заключаются еще в дизайнерской части. Стиль машины в кузове универсал стал немного другим. Хотя это не поможет опознать, едет Kalina или же Granta. Отличить сможет только опытный человек, который действительно посвятил много времени тому, чтобы разобраться в нюансах нового универсала от Lada Granta.

Сзади и по бокам отличий нет вовсе — самая существенная разница находится спереди. Здесь — новый бампер, накладки, немного изменена решетка радиатора. Однако остальное осталось полностью от Lada Kalina. В общем, по большому счету, поменялось лишь название — с Kalina на Granta. По технической части — остался тот же мотор, однако он был усилен на пару лошадиных сил.

Размеры, характеристики

Как стало понятно в материале статьи, новенькая «Лада-Гранта» — это автомобиль «B» класса, который является достаточно компактным и бюджетным. Нынче он выпускается сразу в четырех видах и типах кузова: седан и лифтбек, который был и в первом поколении, и два новых кузова. Это универсал и хэтчбек. Стоит отметить, что у каждой из моделей дорожный просвет достаточно хороший. У «Лады-Гранты» клиренс равняется 190 миллиметрам. Это очень хороший показатель, что позволяет автомобилю ездить по плохим дорогам, не боясь никаких препятствий. Стоит отметить, что у седана размеры кузова таковы: длина — 4,3 м, ширина — 1,7 м, а высота — ровно полтора метра. В общем, достаточно хорошие размеры, особенно ширина.

Дорожный просвет

Подчеркнем, клиренс «Лады-Гранты» размером 190 миллиметров очень хорошо сочетается с подвеской. Именно поэтому новенькая машина очень хорошо ездит, как по плохим дорогам, заснеженным, разбитым, так и просто по обычному асфальту. Автомобиль действительно приспособлен для дорог Российской Федерации.

Платформа и база, на которой строится машина, не претерпела изменений. Все так же, как и было раньше. Поэтому подвеска от первого поколения перешла ко второму. На передней оси установлены независимые стойки, стабилизаторы, а сзади — полузависимая балка. Стоит отметить, что тормоза у «Лады-Гранты» хороши, и путь до полного торможения будет очень мал. А все из-за того, что есть вентиляция тормозных дисков, а также сам барабанный механизм выполнен очень качественно и добросовестно.

Технические характеристики

Новая «Лада-Гранта» оснащается тремя модификациями мотора. Также к ним будут идти на выбор три разных трансмиссии: роботизированная коробка переключения ступеней передач, автоматическая и механическая.

У машины имеется исключительно передний привод. Других модификаций, с задним или полным приводом, у отечественной марки Lada и модели Granta попросту не существует.

Стоит отметить, что широкий выбор разных коробок переключения ступеней передач и двигателей делает машину универсальной. Дорожный просвет (клиренс) «Лады-Гранты» является очень хорошим показателем и делает автомобиль на удивление проходимым.

На вкус и цвет — товарищей нет

Кто хочет более быструю, драйвовую и динамичную езду, выберет механическую коробку переключения передач, чтобы всегда вовремя и по своей воле переключать ступени. Тем самым, динамика во время езды и разгона до 100 километров в час будет очень хорошей.

Кто хочет более комфортную, спокойную езду без неудобств, выберет автоматическую или роботизированную коробку переключения передач. Однако на такой трансмиссии расход топлива будет достаточно высоким, и поездки будут обходиться дорого.

Поэтому для тех людей, для кого бензин — это непосильные затраты, предложена механическая коробка переключения передач, так как именно на ней расход топлива будет самым наименьшим. Дорожный просвет (клиренс) «Лада-Гранта» составляет около 190 миллиметров и позволит без труда преодолевать солидные неровности.

Однако такого комфорта и удобства при вождении не будет. Все таки придется шевелить руками и делать это постоянно.

Стоит отметить, что роботизированная коробка переключения передач также не очень много «поедает» лишнего топлива, так как на ней установлена новая прошивка, позволяющая немного экономить. За дополнительную плату вы сможете перепрограммировать коробку передач и мотор, чтобы уменьшить расход бензина. Однако в этом случае вы теряете гарантию на машину. И совершить эту процедуру можно будет лишь в неспециализированных центрах тюнинга автомобилей.

Результат стоит того, говорят отзывы владельцев «Лады-Гранты». Клиренс лифтбека составляет 190 миллиметров и позволяет проходить неровности, не тратя много топлива на их преодоление.

Двигатель

Под капотом машины имеется мотор на целых 87 лошадиных сил объемом 1,6 литра. За 12 секунд можно разогнаться от нуля до 100 километров в час. Расход топлива у такого двигателя с автоматической коробкой переключения передач составляет около девяти литров на 100 километров пробега по городу. Максимальная скорость — 170 километров в час. С учетом того, какой клиренс у «Лады-Гранты», можно утверждать, что это достойный автомобиль.

Клиренс Лада Гранта в кузове седан

Автомобиль Лада Гранта разрабатывался специально для отечественного потребителя, поэтому при его разработке старались учесть все «отечественные» особенности владения. А какие у нас особенности? Правильно, дороги, вернее часто их отсутствие. Поэтому и клиренс автомобиля хороший, высокий!

Содержание

Клиренс автомобиля Лада Гранта в кузове седан


Заводские данные, которые указывает АвтоВаз на своём сайте, гласят, что клиренс Лада Гранта в кузове седан равен:

Сравнение с конкурентами


Сравним этот показатель с основными ближайшими конкурентами по ценовому диапазону: Рено Логан, Рено Сандеро, Лада Приора, Лада Калина, Киа Рио, Хёндай Солярис.

Следует помнить, что иностранные производители автомобилей хитрят и измеряют клиренс на пустом автомобиле, тогда как АвтоВаз указывает данные при полной загрузке. Клиренс у переднего бампера «пустой» Лада Гранта будет равен 175мм.

Замеры клиренса от журнала «За Рулём»


Эксплуатация в городе и за его пределами


По-своему опыту эксплуатации скажу, что клиренса в 16 см автомобилю Лада Гранта хватает с лихвой.

У моего дома есть отдельная парковка, забраться на которую сложновато. Например, один из моих прошлых автомобилей «Форд Фокус 2 дорестайлинг» забирался на это препятствие с большим трудом.

Также в плане дорожного просвета у Гранты есть один плюс — это B-класс, соответственно он в размерах меньше своих основных конкурентов. Экономим на комфорте, зато получаем плюс в проходимости.

Проехать на дачу, на рыбалку (не сильно «в кущеря»), в частном секторе, в деревню — всё это по силам нашей трудяге Гранте.

Клиренс Лада Гранта на резине 205/50 R15


  • от земли до кромки переднего бампера — 225мм;
  • от земли до самой нижней (выступающей части поддона) — 185 мм;
  • до кромки сварной порога у переднего колеса — 220 мм;
  • тоже у заднего — 220;
  • до кромки заднего бампера — примерно 370 мм;
  • до самой нижней точки между задними колесами (балки) — 240 мм.

Фото на колёсах 17-го радиуса


Увеличение дорожного просвета


Подробно об увеличении клиренса мы уже рассказывали в материале: «увеличиваем клиренс на Лада Гранта, куда уж выше?»

Существуют способы увеличения дорожного просвета. Самые основные из них:

  1. резина с широким профилем

    Один из самых оптимальных размеров резины на Гранту — 185/60 R15

  2. использование проставок (в 90-ые их называли домики)

    Клиренс автомобиля Лада Гранта 20 см в самой нижней точке кузова после установки задних проставок

  3. Использование специальной Cross-подвески (лифтованная).

Отзыв владельца Лада Гранта (Lada Granta) 2012 г.

Лада Гранта, 2012 г.в.


стандарт

Год выпуска: 2012

Кузов: Седан

Двигатель: 1.6 л, Бензин, МКПП, 82 л.с.

Приобретен: Январь 2016 г.

Пробег: 52,300 км

Привод: Передний

Практичность

Надежность

Динамичность

Комфорт

Управляемость

Расходы на авто не указаны

Лада Гранта для меня второй личный автомобиль, до неё владел «семёркой» на которой проездил 4,5 года. Сравнивать Гранту с «семёркой» я не буду, потому что это совершенно разные автомобили.

Ну начнём — Лада Гранта комплектация стандарт, приобрёл в январе 2016 года с пробегом 46000. Грантой очень доволен, если на предыдущей машине приходилось чуть ли не постоянно заниматься каким то ремонтом, то на Гранте я забыл, что это такое, как говориться сел и уехал. Машина мне досталась в очень ухоженном состоянии, предыдущий хозяин буквально пылинки с неё сдувал.

Динамика хорошая, мне хватает, да и вообще я не любитель погонять. Управляемость отличная, четко реагирует на руль. Понравилось то, что на Гранте 3 полных оборота руля, очень удобно. Расход по городу 8-8.5 литров, по трассе 6.5-7 литров, зимой бывает и больше. Очень порадовала проходимость Гранты, куда на ней я только не заезжаю в поисках рыбных, грибных и ягодных мест. Крепкие, надёжные бампера которые прощают многие ошибки. Подвеска на мой взгляд жёсткая, ощущается практически каждая неровность. В салоне просторно, ничего лишнего, на панели всё информативно и понятно. Очень теплая печка. Один из плюсов этого автомобиля, это просто огромный багажник, а после складывания задних сидений он становиться ещё больше.

На данный момент пробег 52300 км, каких-то серьёзных вложений в машину не было, не считая наверное лампочки на ДХО, которые перегорают достаточно часто и сделал шумоизаляцию. На машине стоит всё заводское, ну не считая вышеуказанных ДХО.

Плюсы

* Простота обслуживания
* Проходимость
* Большой багажник
* Надёжность

Минусы

* Жёсткая подвеска
* Часто перегорают ДХО

Стоит ли покупать такой автомобиль? Каким будет Ваше следующее авто?

У меня отец тоже ездит на Гранте, только брал он её с салона в 2012 году тоже комплектация стандарт. Поэтому выбрал гранту, потому что с ней я уже был знаком и знал все плюсы и минусы. Хотя были варианты приобрести Калину или Приору, предлагали даже почти новый ВАЗ-2114. Мой совет берите Гранту, очень хороший автомобиль, уверенно довезёт куда надо, очень неприхотливый.


Эксплуатация: 54,100 км

Замена ремня ГРМ, также заменил помпу так как сильно люфтила и заодно заменил антифриз. Ролик ремня не стал менять, т. к. люфта в ней не было, просто открыл и смазал, а новый ролик оставил на запас.

Добавлено: 31 июля 2016


Эксплуатация: 55,000 км

Замена передних стоек и опорных подшипников, также заехал в сервис сделал сход-развал.

Добавлено: 14 августа 2016


Эксплуатация: 56,840 км

Регулировка клапанов.

Добавлено: 23 сентября 2016


Эксплуатация: 69,500 км

Замена задних ступичных подшипников, задних тормозных колодок и замена обеих тросов ручника.

Добавлено: 23 августа 2017


Эксплуатация: 69,900 км

Замена датчика давления масла

Добавлено: 26 августа 2017


Эксплуатация: 70,500 км

Снова замена ремня ГРМ, ладно хоть клапана не гнёт

Добавлено: 13 сентября 2017


Эксплуатация: 76,500 км

Ну вот и распрощался я со своей первой Грантой. Служила она мне верой и правдой, не когда не подводила. Приобрел другую Гранту, только уже в комлектации Норма, но о ней я напишу отзыв попозже.

Добавлено: 25 января 2018


баксов на ладу гранты. Особенности и технические характеристики авто лада грант. Основные ТТХ Гранты

Бензобак (топливный бак) – емкость в автомобиле, в которой хранится топливо. Обычно бензобак устанавливается сзади в нижней части кузова. Такая компоновка хорошо сказывается на «развесовке» автомобиля. На Lada Granta бензобак выполнен из пластика.

Объем топливного бака Лада Гранта

Сколько эта красавица может залить в нашу Гранту?

Объем топливного бака вне зависимости от комплектации на автомобиле Лада Гранта составляет 50 литров.

Добавьте к этому не более 2 литров, которые будут в топливной магистрали и топливном фильтре, и получите максимальное количество, которое можно залить в этот автомобиль. Это именно то, что рекомендует производитель.

Помните, что перед поездкой нужно только «заправиться до отказа». В противном случае при длительной стоянке под воздействием внешних факторов пары бензина будут испаряться через специальные отверстия в бензобаке. Особенно это будет заметно в жаркую погоду.

При «заправке бака до полного» первый выстрел колонки произойдет уже при 45 л. При этом уровень топлива будет отображаться на панели приборов «без деления до полного». Именно из-за этого возникают споры о том, что бензобак на самом деле меньше объема, заявленного АвтоВАЗом в технической документации. По моему опыту, после первой стрельбы в режиме «медленная заправка» удается залить еще около 6 литров.

Простыми математическими операциями сложения объем всего бензина в системе получается не менее 51 литра , что соответствует информации, заявленной производителем автомобиля.

Внешний вид топливного бака

Сливное отверстие на бензобаке Лада Гранта конструкцией не предусмотрено, поэтому.

Когда загорается сигнальная лампа низкого уровня топлива?

Сигнальная лампа низкого уровня бензина при количестве топлива в бензобаке не более 7 литров.

Заправочные объемы автомобиля Лада Гранта

Для более подробного представления информации мы создали таблицу со всеми заправочными объемами автомобиля Lada Granta. Он представлен ниже.

Название Значение
Система смазки двигателя 3,5
Система охлаждения двигателя и обогрева салона* 7,84
Трансмиссия 3,1
Гидравлическая тормозная система 0,45
Бачок стеклоомывателя 5,0
Топливный бак (емкость) 50

Возможные комплектации ВАЗ Гранта, в которых вы без труда подберете для себя оптимальную.Бюджетная стоимость, высокий клиренс Лада Гранта, позволяющий легко преодолевать бездорожье, доступность в обслуживании, вместительный салон, огромный багажник – вот основные достоинства автомобиля.

Она поделилась платформой для малобюджетного переднеприводного автомобиля ВАЗ Гранта. На сегодняшний день семейство Грантов представлено двумя моделями.

  1. Четырехдверный седан.
  2. Пятидверный лифтбек в трех комплектациях:
  • «стандарт»;
  • «норма»;
  • «люкс».

Технические характеристики Гранты в зависимости от конфигурации будут различаться.

Обзор Лада Гранта 219010

Длина кузова седана 4260 мм, ширина 1700 мм, высота 1500 мм. Колесная база автомобиля составляет 2475 мм. Габариты лифтбека отличаются от седана только длиной кузова, которая немного уменьшилась и составляет 4246 мм. Объем топливного бака (50 л) одинаков для всех модификаций. Объем багажника – 480 литров у седана, 440 литров у лифтбека.

Передние вентилируемые, задние — барабанные. Передняя подвеска независимая, типа McPherson, задняя — рессорная полунезависимая. Снаряженная масса 1115 кг, количество пассажирских мест 5. Силовых агрегатов три, мощностью от 83 до 106 л.с. Трансмиссия – механическая или автоматическая.

Всего возможно 5 комбинаций двигателя и трансмиссии, какую из них выбрать, каждый решает в соответствии со своими требованиями. На минимальную «стандартную» комплектацию устанавливается 1,6-литровый бензиновый двигатель мощностью 83 л.с и простой. Максимальная скорость не превышает 164,5 км/ч, разгон до первой сотни занимает 12,5 секунды.

Максимальный крутящий момент 132 Нм при 3500 об/мин. Минимальный дорожный просвет – 160 мм. Если машина пустая, то дорожный просвет достигает 175 мм. Топливо — бензин АИ-95, расход 9,3 л в городском цикле и 6,2 л — по трассе. В смешанном цикле расход составляет 7,4 литра. Содержание вредных веществ в выхлопных газах соответствует стандарту Евро-4.

Руль выкручивается до упора четырьмя оборотами. Рулевой механизм представляет собой реечный механизм. В пакет оборудования входят дневные ходовые огни, полноразмерная запаска, крепления ISOFIX, складывающиеся задние сиденья, подушка безопасности водителя, аудиоподготовка, инерционные ремни безопасности. Лишь 16% из 20 тысяч проданных автомобилей Lada Granta соответствовали модификации «стандарт». Остальные 84% относятся к «норма» или «люкс».

Что касается Гранты лифтбек, то ее «люкс» планируется оснастить более мощным двигателем на 106 л.с., который будет связан только с механикой. На сегодняшний день лифтбек Granta является самой мощной машиной из этого семейства. Самый слабый мотор для лифтбека – 87 л.с. С участием. Как и седан, пятидверная Granta будет оснащаться как механической, так и автоматической коробками передач.

Вместе с небольшим уменьшением длины кузова уменьшилось и количество кубометров. л багажного отделения и дорожного просвета. Объем багажника лифтбека составляет 440 литров. Но при необходимости его вместимость можно легко увеличить, сняв полку или сложив задний ряд сидений.Минимальный дорожный просвет для автомобилей с АКПП составляет 140 мм, дорожный просвет Гранты лифтбек с МКПП – 160 мм.

Варианты «норма» и «стандарт»

Начиная с «нормы» на Гранту устанавливается 4-цилиндровый рядный двигатель объемом 1,6 л мощностью 87 л. с., который комплектуется новой пятиступенчатой ​​механической коробкой с тросовым приводом, или 1,6-литровым двигателем мощностью 98 л. с., оснащенный автоматической коробкой передач. Для всех версий с АКПП на Гранту устанавливается японский четырехдиапазонный автомат Jatco, разработанный при участии концерна Nissan.

В отличие от своего «бедняги», Грант «норма» разгоняется до 100 км/ч за 11,5 секунды. увеличилась до 167 км/ч. При этом расход бензина уменьшился. Езда по городу потребует 8,5 литров, по трассе – 5,8, смешанный цикл потребляет 7,2 литра топлива. Максимальный крутящий момент — 143 Нм, 3500 об/мин. Количество оборотов руля сократилось до 3. Такие показатели, как дорожный просвет, норма безопасности выхлопа, рулевой механизм, остались такими же, как и в «стандартной» комплектации.

Дополнительное оборудование Гранта «норма» значительно увеличилась. Помимо того, что имеется в «стандарте», в базовое оснащение средней комплектации входят трехточечные инерционные ремни безопасности с индикатором непристегнутых ремней, иммобилайзер, гидравлический корректор фар, бортовой компьютер, первичный прибор, сервопривод рулевого управления. (электро), регулируемая в двух плоскостях рулевая колонка, воздушный фильтр, центральный замок, передние электростеклоподъемники.

По желанию и в зависимости от платежеспособности покупателя автомобиль можно доукомплектовать подушкой безопасности переднего пассажира, системами ABS+BAS, атермальными стеклоподъемниками, кондиционером, заменить инерционные ремни на ремни с преднатяжителем.Lada Granta стала первым российским автомобилем, серийно оснащаемым автоматической коробкой передач. Но если «норму» предпочитают покупать в основном на механике, то АКПП — лидер продаж «люкса».

Lada Granta в «люксовом» исполнении имеет под капотом 1,6-литровый 90-сильный двигатель или заимствованный у Priora 16-клапанный агрегат мощностью 98 л. С участием. Это второй мотор, который может комплектоваться автоматической коробкой передач. Основные характеристики (габариты, клиренс, объем топливного бака, объем багажника, «длина» руля, тип подвески, тормозная система) совпадают с «нормой». Максимальная скорость Lada Grant составляет 168 км/ч. Расход топлива составляет 8,8/5,9/7,4 литра в городском, загородном и смешанном режимах соответственно.

Чтобы разогнать автомобиль с автоматической коробкой передач до сотни, потребуется не менее 13 секунд. Базовое оснащение дополнено мультимедийным комплексом с четырьмя динамиками, противотуманными фарами, центральным замком с дистанционным управлением, датчиком парковки, теплопоглощающей тонировкой, электростеклоподъемниками «по кругу», подогревом передних сидений, электрорегулировкой зеркал, светом и датчик дождя, сигнализация.Дополнительное оборудование: парктроник, климат-контроль, продвинутая шумоизоляция. На этом технический обзор Гранты завершен. Удачи на дорогах!

Лада Гранта

– достаточно популярный автомобиль среди российских потребителей. Его цена приемлема, а эксплуатация значительно дешевле иномарок. Однако не все владельцы могут точно указать основные параметры этой машины.

В этой статье мы расскажем какой объем топливного бака у Лада Гранта.

Немного о Гранте

Как известно, производитель создал Lada Granta на базе более ранней модели — Kalina.Сейчас автомобиль представлен на рынке в четырех версиях:

.
  • лифтбэк;
  • седан;
  • хэтчбек;
  • спорт.

Также есть три типа оборудования. И люксовая версия, и «Стандарт» и «Норма» оснащаются 1,6-литровыми двигателями различной мощности. Сначала автомобиль снабжали силовыми установками на 8 клапанов, но затем появились 16 клапанов.

Во всех модификациях используется 5-позиционная коробка передач. Он может быть автоматическим или ручным.Передние колеса ведущие.

По стандарту расход топлива на сто километров составляет:

  • в городских условиях — 8,7-9,3;
  • по шоссе — 5,8-6,2;
  • смешанный цикл – 7,2-7,3 литра.

Гранта способна развивать максимальную скорость более 168 километров в час. Чтобы разогнаться до сотни, ей нужно максимум 12 секунд.

Бензобак устанавливается на Гранту сзади, под кузовом, с правой стороны.Такая компоновка позволяет идеально сбалансировать автомобиль, что, в свою очередь, способствует более легкому управлению. Топливный бак изготовлен из пластика.

Помимо прочего, конструкторы в ходе разработки рассматриваемого автомобиля также внесли определенные изменения в устройство подвески. В частности, спереди был установлен более широкий кастер, что положительно сказалось на курсовой устойчивости. транспортное средство.

При этом обновилась и рулевая рейка, она теперь несколько короче той, что ставилась на Калину, благодаря чему на полный оборот требуется всего три оборота руля.Это значительно облегчило управление машиной.

Передняя подвеска также имеет новый модуль стоек, конструкция которого претерпела ряд изменений и в результате получила совершенно новые характеристики.

Стабилизаторы, придающие боковую устойчивость, используются более прочные, а также опоры кузова.

Не обошел вниманием при модернизации и заднюю подвеску. Так Гранта стала первой в истории Волжского автозавода машиной с отрицательными значениями развала.И эта мера позволяет значительно улучшить управляемость автомобиля.

Какой объем бензобака

Также следует помнить, что полный бак целесообразно заправлять только в ситуациях, когда предстоит дальняя дорога. В противном случае деньги, потраченные на поставку топлива, будут буквально выброшены на ветер. Все дело в том, что под воздействием внешних факторов топливо испаряется и уходит в атмосферу через специальные отверстия, проделанные в баке. Наиболее быстро этот процесс происходит в жаркое время года.

Как правило, «выстрел» заправочного пистолета в первый раз происходит после заливки в бак 45 литров топлива. При этом индикация на панели приборов будет показывать, что бак не заполнен на одно деление шкалы. Это обстоятельство привело к тому, что многие автолюбители полностью убеждены в том, что бензобак Гранты на самом деле меньше, чем заявляет производитель в сопроводительной документации. Но знающие специалисты отмечают, что после «выстрела» легко залить до 6 литров топлива.

Таким образом, если все сложить, то получается, что общая емкость бензобака в Гранте составляет не менее 51 литра. И это полностью соответствует заверениям конструкторов.

При создании Гранты завод не предусмотрел возможность слива бензина из бака — в нем нет для этого специального отверстия. Поэтому при необходимости топливо удаляется через рампу или топливный фильтр.

Сигнал об исчерпании запаса бензина подается сразу после уменьшения его доступного объема до 7 литров.

Прочие объемы наполнения


Данная информация будет полезна всем владельцам автомобиля Гранта, так как позволит эффективнее планировать расходы на эксплуатацию автомобиля. Итак:

  • Система смазки силовой установки имеет объем 3,5 литра;
  • на охлаждение и обогрев для работы — 7,84 литра антифриза;
  • КПП — 3.1;
  • тормозные гидроприводы — 0,45;
  • Емкость омывателя лобового стекла – 5;
  • Емкость топливного бака
  • — 50.
Лада Гранта

седан (ВАЗ 2190) — новый автомобиль отечественного автопрома, созданный на базе Калины образца 2004 года. Серийное производство народного автомобиля стартовало осенью 2011 года, а первая машина была продана 22 декабря. Выдача первых экземпляров осуществляется только тем, кто заранее оставил заявку на промо-сайте автомобиля. Седан Лада Гранта призван заменить в линейке АвтоВАЗа сразу несколько моделей – классику, семейство Самара и седан Лада Калина.По своим техническим характеристикам седан Lada Granta превосходит перечисленные автомобили. Это обосновано новыми материалами, улучшенным качеством сборки, а также новыми технологиями, впервые примененными на отечественных автомобилях.

Таблица с техническими характеристиками Lada Granta

1,6 л. 8-кл.
(Евро 4) 82 л.с.
1,6 л. 8-кл.
(Евро 4) 87 л.с.
Длина, мм 4260 4260
Ширина, мм 1700 1700
Высота, мм 1500 1500
Основание, мм 2476 2476
Колея передних колес, мм 1430 1430
Колея задних колес, мм 1414 1414
Объем багажного отделения, куб. дм. 480 480
Масса в снаряженном состоянии, кг 1160 1160
Полная масса автомобиля, кг 1560 1560
Допустимая полная масса буксируемого прицепа с тормозами, кг 900 900
Допустимая полная масса буксируемого прицепа без тормозов, кг 450 450
Колесная формула / ведущие колеса 4×2 / передний 4×2 / передний
Компоновка автомобиля передний привод, расположение двигателя спереди, поперечное
Тип кузова/количество дверей седан/4 седан/4
тип двигателя бензин, четырехтактный бензин, четырехтактный
Система снабжения распределенный впрыск с электронным управлением
Количество и расположение цилиндров 4, рядный 4, рядный
Объем двигателя, куб. см 1596 1596
Максимальная мощность, кВт/л.с./об/мин 60/82/5100 64/87/5100
Максимальный крутящий момент, Нм при об/мин 132/3800 140/3800
Топливо Бензин неэтилированный АИ-95 (мин)
Расход топлива по ездовому циклу, л/100 км 7,3 7,2
Максимальная скорость, км/ч 164 167
Трансмиссия с ручным управлением с ручным управлением
Количество передач 5 вперед, 1 назад 5 вперед, 1 назад
Передаточное число главной пары 3,7 3,7
Рулевое управление Реечный рулевой механизм Реечный рулевой механизм с электромеханическим усилителем руля
Шины 175/70 R13 (82, Т, Н) 175/65 R14 (82, Н)
Емкость топливного бака, л 50 50


Сравнение габаритов Lada Granta и Lada Kalina (увеличить)

Информация о цене

Пока в продаже только автомобили в двух комплектациях: стандарт и норма, и только в кузове седан. Хэтчбеки поступят в продажу в начале 2013 года. Стартовая цена автомобиля в базовой комплектации – 229 тысяч рублей. Полный комплект нормы обойдется в 256 тысяч, а за диски придется доплатить еще 8000 рублей. Стоимость «люксовой» версии точно пока не известна, но, по словам представителей АвтоВАЗа, она не превысит 270-280 тысяч рублей. С середины 2012 года в продажу могут поступить автомобили Lada Granta с японской автоматической коробкой передач. Сколько будет стоить такая Гранта, неизвестно, но представители АвтоВАЗа говорят, что стоимость автомобиля с АКПП составит около 300 тысяч рублей.

Комплектация Лада Гранта

Безопасность Стандарт Норма Люкс
Убирающиеся ремни безопасности + +
Инерционные ремни с преднатягом +
Подушка безопасности водителя + + +
Подушка безопасности переднего пассажира +
Подголовники задних сидений +
АБС+БАС +
Внешний вид
Бамперы в цвет кузова + +
Дневной ходовой огонь в фаре + + +
Колесные диски штампованные, 13 +
Колесные диски штампованные, 14 +
Литые колеса, 14 шт. 8 000 руб. +
Колесные колпаки +
молдинг решетки + +
молдинги дверей +
Наружные зеркала заднего вида, окрашенные в цвет кузова +
Дверные коробки черные +
Интерьер
Обивка дверей с декоративными вставками + +
отдельное заднее сиденье +
Отделка порога пола +
Уплотнители порогов пола +
контейнер для очков +
Комфорт
Рулевая колонка с регулировкой по высоте + +
электроусилитель руля + +
Передние электростеклоподъемники + +
Задние электрические стеклоподъемники +
Атермальные очки +
Воздушный фильтр салона + +
Кондиционер +
Наружные зеркала с подогревом и электроприводом +
Подогрев передних сидений +
Замок багажника с электроприводом + +
Электроника
центральный замок + +
Бортовой компьютер + +
Охранная сигнализация +
Дистанционное управление замками и крышкой багажника + +
Аудиосистема +
Стоимость, руб. 229 000 256 000 нет данных

Опытный водитель знает, какой бензин заливать, следя за реакцией своего автомобиля на разные виды топлива. Правильно подобранный бензин играет важную роль в поддержании работоспособности и механизмов автомобиля Лада Гранта. из сотен подобных предложений — настоящее искусство, которое водитель освоит только со временем.

Критерии выбора бензина

Выбирая подходящий вариант топлива, автовладелец должен взять за основу ряд правил:

  1. В случае, если буду эксплуатироваться как в теплое, так и в холодное время года, рекомендуется обращать внимание на класс испаряемости приобретаемого бензина.Требования к этому веществу различаются в зависимости от области эксплуатации, однако в большинстве своем поставщики стремятся предложить универсальный продукт, который и следует выбирать для автомобиля Лада Гранта.
  2. Бензин не должен содержать опасных примесей, таких как свинец, железо или марганец. Такой продукт по праву считается некачественным и может привести к выходу из строя топливной системы автомобиля.
  3. Большинство производителей, стремясь защитить бак от коррозии и разрушения, добавляют в бензин так называемые присадки.Однако не стоит самостоятельно добавлять такое вещество в готовый продукт. Лучше будет приобрести продукт премиум-класса, который обеспечит максимальную защиту.

В реальной жизни выбор варьируется в пределах двух марок заливаемого в бак бензина: 92-й и 95-й. Отечественные водители с одинаковым успехом используют оба варианта, но определить лучший из них довольно сложно.

Производитель Lada Granta рекомендует использовать именно 95-й бензин из-за его Высокого Качества.Такой бензин поставляется очищенным, без примесей. Кроме того, он обладает очищающими свойствами, к которым довольно двойственное отношение. С одной стороны, такое топливо не пропускает пыль и грязь в бензобак, с другой стороны, при постоянном использовании оказывает разрушительное воздействие на сам металл.

Гораздо более щадящим по праву считается 92-й бензин, не содержащий ничего, кроме сырья, предусмотренного технологией изготовления. Кроме того, заправка этого изделия будет на порядок дешевле его 95-го аналога.

При выборе подходящего бензина автовладелец должен обращать внимание на рекомендации, которые дает ему производитель, и адаптировать их к своему региону и потребностям автомобиля.

Как заправить бензин самостоятельно?

Решив, какой бензин заливать, автомобилист может отправиться за горючим на АЗС, где на помощь придет профессиональный заправщик. Однако в некоторых случаях ему придется заливать бензин самостоятельно.

Чтобы не остаться без топлива в самый непредсказуемый момент, важно постоянно проверять уровень заполнения топливного бака.

Вам может понадобиться дозаправиться в дороге, поэтому всегда нужно иметь при себе канистру и воронку.

Заправиться, когда остается менее половины бака. Многие неопытные водители предпочитают ехать до тех пор, пока на приборной панели не загорится лампочка, указывающая на то, что контейнер почти пуст. Эта практика довольно рискованна и может значительно навредить двигательной системе. Бензин охлаждает топливный насос, который при перегреве просто лопнет. Если бак заправлен по правилам, можно смело ехать на заправку.

При подъезде к АЗС важно правильно припарковать автомобиль перед заправочной машиной с той стороны, на которой находится крышка бензобака. Машину желательно ставить таким образом, чтобы бензобак и заправка находились на одном уровне. После этого открутите крышку бензобака и вставьте в нее заправочный пистолет соответствующей марки.

После этого необходимо произвести оплату и указать, сколько литров топлива требуется. Вернувшись к машине, нужно нажать рычаг на пистолете, тогда топливо будет подаваться автоматически.

При этом автолюбитель также должен знать, как слить бензин из бака, если ему попался некачественный товар. Это можно сделать тремя основными способами.

Слишком маленький, чтобы его увидеть? Не РАДУЙТЕСЬ!

То, что что-то нельзя увидеть, не означает, что это нельзя изучить.

Введение в нанотехнологии — крошечные структуры, которые ученые могут создавать для изучения и решения микроскопических задач.

Дженнифер Стил, доктор философии, заведующая кафедрой и профессор физики, по этой причине любит изучать нанотехнологии.«Мы делаем молоток для очень специальных гвоздей, — объясняет Стил. — Мы смотрим на проблему, для решения которой нужен новый инструмент, и мы разрабатываем структуру, которая поможет нам лучше понять проблему и ее решение. ”

Лаборатория Стила в настоящее время изучает перенос энергии флуоресцентного резонанса (FRET) — метод, который ученые могут использовать для измерения относительного расстояния между микроскопическими молекулами, такими как белки в наших клетках, которые находятся на расстоянии всего лишь нанометров или ангстрем друг от друга. FRET может сделать это на основе взаимодействия между парным набором флуоресцентных молекул. Если молекулы находятся достаточно близко друг к другу, одна молекула, донор, отдает свою энергию другой молекуле, акцептору, для создания флуоресцентного сигнала, испускающего яркий свет. «Вы можете использовать эту передачу энергии как своего рода нанометровые линейки — очень, очень точные линейки», — добавляет Стил.

Но, по словам Стила, яркий свет не всегда является достаточно сильным сигналом. Ее работа сосредоточена на усилении этого сигнала.Большая часть текущей работы, связанной с FRET, сосредоточена на использовании инженерных наночастиц, которые имеют один широкий оптический резонанс, который может усиливать сигнал от многих длин волн или цветов света. Однако Стил считает, что это может быть чрезмерным упрощением. Ее группа студентов-исследователей работает над созданием наноструктурированных поверхностей с узкими оптическими резонансами, которые могут двигаться во всем диапазоне длин волн света. Таким образом, они смогут лучше понять физику процесса и, таким образом, смогут лучше усиливать флуоресцентную сигнализацию FRET.

Для поддержки своих исследований Стил получила трехлетний грант в размере 257 090 долларов США от Отдела исследования материалов Национального научного фонда. Грант включает около 70 000 долларов на новое оборудование, а также восемь летних стипендий для студентов Тринити в течение следующих трех лет. Хотя из-за COVID-19 Стил отстает от графика на несколько месяцев, она планирует начать сбор данных предстоящей весной.

«Поскольку большая часть работы для FRET вращается вокруг этих структур, которые имеют один оптический резонанс, а структуры, которые мы делаем, имеют их целый ряд, я чувствовал, что [другие исследователи] не улавливают всей картины». — говорит Стил.«И именно это стремление не пускать этот вопрос в голову дает вам мотивацию написать грант, а затем выполнить работу. Я думаю, что они что-то упускают в интерпретации, и мы собираемся это выяснить».

Обнаружение внутриклеточных микроРНК (миРНК) привлекает все большее внимание, что привело к значительным достижениям. Однако разработка доступного инструмента, обладающего удовлетворительным соотношением сигнал-фон и высокой чувствительностью для обнаружения микроРНК, остается сложной задачей.Здесь был разработан класс катализируемых теломеразой FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции) ratioflare для точного обнаружения малочисленных связанных с раком миРНК как во флуоресцентном анализе, так и в визуализации живых клеток с возможностью усиления сигнала. В этой работе эндогенная теломераза впервые используется в тест-системе микроРНК с усилением сигнала, где теломераза удлиняет гексамерные теломерные повторы (TTAGGG), используя 3′-конец зонда захвата в качестве праймера. Синергетическая работа теломеразы и цепи катализатора ( CS ) заставляет микроРНК-мишень циркулировать в системе, что приводит к высокой чувствительности и усиленному сигналу FRET с улучшенным пределом обнаружения до 2. 27 × 10 −15 M. Между тем, катализируемые теломеразой FRET ratioflares позволяют надежно увеличить разницу между раковыми и нормальными клетками. Кроме того, благодаря логометрическим измерениям достигается низкий уровень ложноположительных сигналов, возникающих из-за химических помех, и минимизация колебаний системы.

Эта статья находится в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Заголовок Time, посвященный страху перед долгами, — это журналистское — и экономическое — крушение поезда

Журнал Time безмерно гордится своей обложкой на этой неделе, провозглашенной кроваво-красной иллюстрацией, объявляющей каждому читателю, что он или она должен 42 998 долларов.12 как часть государственного долга.

Трудно найти повод для гордости. Статья под названием «Сделаем Америку снова платежеспособной» плохо аргументирована, упрощена, противоречива и откровенно идеологизирована. Он искажает историю и превозносит экономическую политику, которая была дискредитирована несколько десятилетий назад. Его немногочисленные крупицы правды и рациональности затоплены потоком неправды.

Что особенно любопытно в этом эпизоде, так это то, что Time решил доверить свою обложку постороннему. Автором является Джеймс Грант, основатель (в 1983 году) и редактор независимого информационного бюллетеня Grant’s Interest Rate Observer долгое время являвшийся одним из наших самых скептических летописцев деловых и экономических тенденций.

Если вы являетесь подписчиком, вы держите что-то вроде предмета коллекционирования.

— Редактор Time Нэнси Гиббс, говорящая громадину

Противоречивое письмо Гранта получило признание за его проницательность и остроумие. Он заработал все то пожизненное признание, которое получил в прошлом году от премии Джеральда Леба (считайте их Пулитцеровской премией для деловых журналистов). Статья на обложке журнала Time может разрушить его репутацию. Последователей Гранта не удивит, что он сторонник золотого стандарта и критик Федерального резерва; шоком может стать слабость его аргументов.

В любом случае, Time не дает никаких указаний на то, что Грант подходит к проблеме государственного долга не как нейтральный наблюдатель, а с определенной философской позиции. «Поскольку мы отмечаем налоговый день, — вежливо пишет редактор Time Нэнси Гиббс в письме к читателям, представляя сочинение на обложке, — уместно вспомнить, как указывает Грант, что доля федерального долга в размере 42 998,12 доллара для каждого американца в конечном итоге представляет собой форма отсроченного налога, который должен быть уплачен в один прекрасный день».

Джеймс Грант (обозреватель процентной ставки Гранта)

История на обложке журнала Time от 25 апреля уже набирает обороты.В Slate Джордан Вайсманн называет это «непростительно идиотским… Dorito в статистической форме». Мэтт О’Брайен из Washington Post написал в Твиттере, что его основное утверждение о том, что США фактически неплатежеспособны, «пагубно глупо». Экономист Дин Бейкер называет пугающий заголовок «невероятно глупым… Это не имеет ничего общего с будущим уровнем жизни людей, ничего общего со способностью правительства погасить свои долги. Это практически нулевая информация».

Давайте просто выделим несколько пунктов Гранта, чтобы показать, что он на самом деле говорит, и где, по нашему мнению, он ошибается.

Долг: «Лучше не брать на себя.» Грант начинает сразу со странного утверждения: «Вот что я узнал о долгах после 40 лет написания и изучения: лучше не брать на себя их. Если они возникли, лучше их погасить».

Грант действительно в это верит? Явно нет, так как несколькими абзацами позже он пишет: «Долг сам по себе не является ни хорошим, ни плохим». Это утверждение верно.

Дело в том, что во многих случаях в бизнесе и личных финансах принятие долга является правильным выбором.Как инструмент привлечения капитала, долг почти всегда дешевле, чем собственный капитал: долг обычно представляет собой фиксированную плату за денежный поток, но собственный капитал требует, чтобы бизнес навсегда отказался от части своей прибыли. Если вы только начинаете и вам нужно финансирование, скажем, для создания запасов, покупки оборудования и найма персонала, вы обычно не хотите отдавать часть компании для удовлетворения краткосрочных потребностей. Проценты по долгу также не облагаются налогом. Что касается оплаты, это зависит. Если процентная ставка по кредиту, вероятно, будет ниже, чем прибыль, которую можно получить, инвестируя принцип, а не возвращая его — скажем, инвестируя его в бизнес — нет смысла отказываться от этого капитала, а не нести расходы. этого.

США в плюсе: государственные активы никогда не опускались ниже государственного долга. (Томас Пикетти)

Грант мог бы найти где-нибудь в своем эссе из 2100 слов, чтобы подтвердить это. Но он этого не сделал. Самое близкое, что он подошел, это к беспокойству о том, что низкая процентная ставка по федеральному долгу сегодня опасна , потому что поощряет увеличение заимствований. Тем не менее, с точки зрения политики, истина прямо противоположна: это как раз подходящее время для того, чтобы правительство взяло на себя больше долга, потому что брать кредиты для строительства и ремонта инфраструктуры, которые принесут гораздо больший экономический рост, чем в среднем 1, обходится дешево.8% в год стоит его финансировать.

«Мы должны больше, чем можем легко погасить.»  В этом суть аргумента Гранта о том, что правительство фактически неплатежеспособно. Техника Гранта знакома нам по проверке только одной стороны бухгалтерской книги. Да, у государства есть обязательства, но есть и активы. Сложите их вместе, и Соединенные Штаты окажутся в большом плюсе, как задокументировал экономист Томас Пикетти в своей книге «Капитал в двадцать первом веке».

Что принадлежит правительству? Начните с запасов энергии.Институт энергетических ресурсов оценил их в 128 триллионов долларов, чего достаточно, чтобы погасить почти весь федеральный долг в размере 13,9 триллионов долларов (по подсчетам Гранта) самостоятельно. Кроме того, есть его обширный перечень зданий и земли и стоимость монополий, которые он имеет право раздавать за плату в виде патентов, авторских прав и другой ренты. Давайте не будем упускать из виду, как это делает Грант, что расходы, финансируемые за счет долга, создают новую ценность. Иногда они строят школы или административные здания; иногда они платят за национальную оборону, будь то корабли или самолеты, или в смысле безопасности, которым питается американская торговля.Присваивать этим активам нулевую стоимость — консервативный прием, но нечестный.

Управляем ли федеральный долг? Процентные платежи так же низки, как и за более чем полвека. (Данные: Федеральный резервный банк Сент-Луиса; концепция: IBT)

Что касается утверждения о том, что обслуживание долга на душу населения в равной степени ложится бременем на каждого американца (или каждого подписчика Time), это просто тактика запугивания. Основная сумма может пролонгироваться на постоянной основе, а процентные начисления сами по себе снижаются в процентах от валового внутреннего продукта; в настоящее время они составляют самую низкую долю экономики за более чем 50 лет.

Грант утверждает, что низкие процентные ставки, которые мы сегодня выплачиваем по нашему долгу, заводят нас в дурацкую игру, потому что день, когда ставки вырастут, обязательно наступит. «При ставке 4,8%, преобладавшей еще в 2007 году, правительство будет платить больше на процентные расходы — 654 миллиарда долларов, — чем на национальную оборону», — пишет он. Это так, но сигнал, исходящий от того, что Грант назвал «мистером Рынок», не указывает на это. Что может повысить ставки? Во-первых, это может быть всплеск экономического роста, но это будет означать увеличение ВВП, которое, как правило, будет поддерживать отношение процента к ВВП.

Грант предупреждает, что карусель низких ставок «в конце концов остановится». Но он не будет ставить когда. «Я не знаю даты, — пишет он, — но мне кажется, что я знаю причину. Это остановится, когда мир потеряет доверие к долларам, которые мы должны… Можно предположить, что кредиторы доверяют валюте, в которой они ожидайте возмещения. Интересно, почему и как долго». Он не говорит, что может привести к моменту истины для Америки, и не признает, что на протяжении почти столетия мировые кризисы и экономические спады, как правило, заставляли СШАС. экономика, а значит, и вера в доллар, сильнее.

Грант, вероятно, прав, что в какой-то момент карусель остановится. Но высказывание о том, что мы должны радикально изменить политику сегодня из-за события, которое может произойти в неопределенном будущем, не очень ценно в качестве рецепта, тем более, что это налагает реальные расходы на некоторых представителей общественности, таких как рабочий класс, в обмен на предполагаемую гарантию для других, а именно держателей облигаций. Грант сглаживает этот дисбаланс, предполагая, что каждый американский мужчина, женщина и ребенок сегодня несут одинаковое бремя расходов, но это явно неверно; в той мере, в какой это бремя, возможно, большее бремя ложится на тех, кто получает наибольший доход и платит наибольший подоходный налог.Предложения Гранта переместят бремя долга ниже по шкале доходов.

Ответ: золотой стандарт? Преданность Гранта золоту была широко отмечена и вновь появляется здесь. Понимают ли редакторы Time, что они уступили свое место призыву вернуться к ретроградной экономической теории или последствиям такой политики?

Как я задокументировал здесь, в последнее время золотой стандарт стал чем-то вроде моды в республиканской президентской политике. Но его привлекательность ограничена даже среди консерваторов. Джеймс Петокукис, комментатор Американского института предпринимательства, написал: «Я очень надеюсь, что они несерьезны, и это просто глупость сезона кампании». Сам Грант признает, что золотой стандарт работает до тех пор, пока не перестает работать, как это произошло во время «депрессии 1930-х и войны 1940-х». Он мог бы добавить, что, связав руки политикам, золотой стандарт, вероятно, обрек бы развитые страны на долгие годы экономической катастрофы после 2008 года.

Что касается расходов, вызванных отсутствием привязи к золоту, Грант пишет, что «распространение долларов способствует крупным заимствованиям. Сверхнизкие процентные ставки маскируют затраты». Да, но «сверхнизкие процентные ставки» стоят затрат. Это все равно, что сказать, что только молоко и яйца выглядят дешевыми в супермаркете, потому что нас вводят в заблуждение их низкие цены.

Единый налог: «Идентичная низкая ставка для большинства доходов». Единый налог — это консервативный республиканский афоризм, и удручающе видеть, как «мудрый экономический аналитик» вроде Гранта покупается на очевидное мошенничество.Покойный Герберт Штейн, главный экономист администрации Никсона и необычайно мудрый консерватор, положил миф о едином налоге в могилу в статье Wall Street Journal в 1996 году, когда эта концепция была обстреляна такими кандидатами в президенты, как Стив Форбс и Джек Кемп (как сегодня Тед Круз и др.). Заметив, что все такие предложения предусматривают освобождение первых нескольких тысяч доходов от налога для защиты людей с низкими доходами, он заметил, что на самом деле не существует такой вещи, как «одинаковая ставка для большинства доходов».»

О планах, циркулировавших в 1990-х годах, Штейн писал: «Люди с доходом ниже личного освобождения будут платить нулевой налог, люди с доходом в два раза больше, чем освобождение, будут платить 10% от их общего дохода, люди с 10-кратным освобождением будут платить 18%. от их общего дохода, а люди со 100-кратным освобождением будут платить 19,8%». Он заметил, что это прогрессивная система, а не фиксированный налог, и единственным предметом споров был вопрос, насколько прогрессивен. Он предложил правило, «выведенное из 60-летних наблюдений…. Какой бы ни была существующая степень прогрессии, люди, которые платят по максимальной ставке, сочтут ее слишком большой.»

Социальное обеспечение: «Вы не упустите доход, к которому никогда не прикоснетесь».  Грант просит своих читателей проверить свои зарплатные чеки и «обратить внимание на доллары, удержанные для Medicare, Social Security и так далее». Это тот же самый консервативный трюк: делать вид, что на удержанные средства ничего не купить.

Грант, как и многие другие консерваторы, использует слово «право» как ругательство.По правде говоря, Социальное обеспечение и Медикэр являются «правами», потому что их бенефициары платили за них из своей зарплаты.

Грант повторяет известную критику о том, что «нет счетов, предназначенных для вас, гражданина, который так добросовестно «вносил» ваши налоги на заработную плату».

На социальное обеспечение приходится более половины дохода двух третей пенсионеров или супружеских пар и 90% или более дохода 35% всех пенсионеров. (Администрация социального обеспечения)

Это вводит в заблуждение.Пособия по социальному обеспечению установлены законом, и для их отмены потребуется акт Конгресса. Если Грант думает, что наши федеральные законодатели справятся с этой задачей, то почему он также пишет , что «политики… увеличивают льготы, которые они обещают пенсионерам (факт, о котором штатным и федеральным пенсионерам рекомендуется помнить в день выборов)».

Как и многие другие дротики Гранта, этот не выдерживает тщательной проверки. Конгресс не расширял пособия по социальному обеспечению с 1960 года (хотя должен был бы).Пособия подлежат ежегодному увеличению прожиточного минимума, но увеличение на 2016 год — год выборов, если вы не заметили — равно нулю.

Спросите пенсионеров, получающих пособие по социальному обеспечению, или тех, кто лечится по программе Medicare, не пропали ли потраченные ими деньги. Можно с уверенностью сказать, что подавляющее большинство согласится с тем, что им повезло получить ежемесячный чек социального обеспечения. (На социальное обеспечение приходится более 90% дохода примерно трети всех пенсионеров или супружеских пар и более половины дохода двух третей пенсионеров.) Наверняка выразят облегчение, узнав, что Medicare покрывает их потребности в медицинском обслуживании. Эти программы были приняты именно из-за волны бедности и плохого здоровья, поразившей пожилых людей Америки.

В своем письме читателям Гиббс создает впечатление, что она и ее журнал ничего не знают о Гранте и еще меньше об экономической политике: он «мудрый экономический аналитик», пишущий с «освежающей искренностью и ясностью». Трудно избежать вывода о том, что редакторы Time были обмануты, запустив идеологическую белиберду, полагая, что это был акт репортажа.То, что они выбрали откровенно паникерскую и фактически неверную линию прикрытия для ее рекламы, только усугубляет ошибку.

Это не означает, что аргумент Гранта неуместен в публичных дебатах, просто он представляет определенную экономическую точку зрения. На протяжении многих лет он был убедительным и интересным представителем этой точки зрения. Но как политика, это очень 1920-е годы. С другой стороны, журнал Time был основан в 1923 году. Кто бы мог подумать, что журнал все еще живет в ту эпоху?

Будьте в курсе новостей с Майклом Хилциком.Подпишитесь на @hiltzikm в Твиттере, посетите его страницу в Facebook или отправьте электронное письмо по адресу [email protected]

Вернуться в блог Майкла Хилцика.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo.

Плазмидная конструкция. кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были созданы с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР.Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2)

43 и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип биосенсора FRET активности ERK, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для флуоресцентных белков донора и акцептора соответственно 19 . В дальнейшем белки, полученные из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, происходящие из YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена амплифицированной с помощью ПЦР кДНК, кодирующей слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x 19,44,45 и RaichuEV-Ras 19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для получения hyBRET-PicchuX и hyBRET-HR соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP на Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 с помощью реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены YPet mVenus dC10 путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты NanoLuc hyBRET-ERK также были получены с помощью реакции In-Fusion. Ранее сообщалось о CeNL, слитом белке Turquoise2 и NanoLuc 22 . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser/Thr сенсорный домен и соответствующий домен лиганда в hyBRET-ERK были заменены доменами из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, в результате чего были получены hyBRET-PKA, JNK и S6K соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS 47 или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к S-бластицидину) 48.Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки кДНК, кодирующих компоненты hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину S) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP 49 . Остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK затем заменяли аланином для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта, hyBRET-ERK-TA, путем рестрикционного расщепления и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Для конструирования векторов для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих кДНК RLuc8 S257G dN3 встраивали в вектор CSII-EF с помощью IRES-puro, а кДНК цианового нанофонаря и желтого нанофонаря подвергали ПЦР-амплификации и субклонировали в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее 50 . Для получения pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующую mCherry, амплифицировали с помощью ПЦР и сливали с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкерным и каталитическим доменом мышиного Sos1 (аминокислоты 548–1020) или интер-Sh3-доменом человеческого p85 (аминокислоты 428–621), в результате чего была получена pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK конструировали следующим образом: инсулятор D4Z4 вставляли перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущим сайты рекомбинации Tol2 51 . Затем последовательность WPRE pCSII-EF вставляли перед последовательностью поли-А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resource Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из ATCC (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Mountain View, CA). Клетки PC9 были любезным подарком Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в среде RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллином/стрептомицином (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере 5% СО2 на воздухе при 37 °С. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase 48 , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг/мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение как минимум 1 недели. Для производства лентивирусов клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260), и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, который был любезным подарком от Dr. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) путем липофекции с использованием полиэтиленимина ‘Max’ MW 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Вируссодержащие среды собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью ПЭГ6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг/мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после инфицирования инфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг/мл бластицидина S. Массовую популяцию клеток использовали в последующих анализах.

Реагенты

Диацетил коэлентеразин-h был синтезирован, как описано ранее 14 . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены у Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и эпидермальный фактор роста были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для плазмидной липофекции в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Madison, WI), а субстрат для анализа, включенный в набор, использовался в качестве маточного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в Таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP или биосенсор, помещали на 35-мм стеклянную чашку. Клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного объективом (масляный объектив UPLAPO 100×/1,35 NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438/24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждались фильтром возбуждения S492/18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции записывали с интервалом 2 нм с помощью многоканального фотонного анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, трипсинизировали и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К клеточной суспензии добавляли 20 мкМ коэлентеразина-ч или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью ПМА-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции использовали для оценки эффективности переноса энергии биосенсоров.

Оценка эффективности переноса энергии

Для оценки эффективности переноса энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были сопоставлены с теоретическими спектрами излучения, как сообщалось ранее 20 . Для нелинейной регрессии использовали метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Natick, MA), и функцию решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

{E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y}(\лямбда),$$

(1)

где F( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε c ( λ бывший ) – коэффициент возбуждения УФП на длине волны возбуждения, E CY — эффективность FRET между CFP и YFP, ϕ C — квантовая эффективность CFP, f C ( λ ) – нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ Y — квантовая эффективность YFP, f Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε Y ( λ бывший ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε Y ( λ бывший ) значение при 440 нм, представляющее перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε Y ( λ бывший ) значение при 513 нм.

Если предположить, что внутрирамочное слияние RLuc8 на С-конце не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические спектры биолюминесценции описываются следующим уравнением:

$$\begin{array}{rcl}{ \rm{B}}(\lambda ) & = & {E}_{RC}\times (1-{E}_{CY})\times {\varphi}_{C}\times {f}_{ C}(\lambda)+({E}_{RY}+{E}_{RC}\times {E}_{CY})\times {\varphi}_{Y}\times{f}_{ Y} (\ lambda) \\ & & +\, (1-{E}_{RC}-{E}_{RY})\times {\varphi}_{R}\times {f}_{R }(\лямбда),\конец{массив}$$

(2)

где B( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E RC — эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ R — квантовая эффективность RLuc8, а f R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

Е КИ оценивали путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 1. E RC Предполагается, что является постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и для стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E RC Нанофонаря используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нанофонаря, ϕ CNL , выражается следующим уравнением:

$${\varphi}_{CNL}={\varphi}_{C}\times {E}_{RC} +{\varphi}_{R}\times (1-{E}_{RC}),$$

(3)

Используя данные о квантовой эффективности, показанные в таблице S1, E RC было определено как 0,13. Наконец, E RY оценивали путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к уравнению. 2. Значения ε и ϕ перечислены в таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$\begin{array}{rcl}{\rm{B}}(\lambda ) & = & {E}_{NC}\times (1-{E}_{CY})\times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \varphi}_{N}\times {f}_{N}(\lambda),\end{массив}$$

(4)

где B( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E NC — эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NY — эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ N — квантовая эффективность NanoLuc, а f N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc. Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NC , также был оценен по уравнению. 4, установка E Нью-Йорк и E CY как ноль.

Интервальная визуализация культивируемых клеток

Интервальные изображения были получены и обработаны с использованием практически тех же условий и процедур, что и ранее 52 .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, подвергались голоданию в течение 3–8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. Голодные клетки обрабатывали стимулом во время покадровой визуализации, если это необходимо. Клетки визуализировали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Tokyo), оснащенного объективом (масляный объектив UPlanSApo 60×/1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Beaverton, OR), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор с верхним столиком INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония). В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: охлаждаемая ПЗС MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), охлаждаемая EMCCD iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и охлаждаемая EMCCD Rolera Thunder (QImaging, Surey, Британская Колумбия). . Для визуализации FRET клетки подвергались воздействию света с длиной волны 440 нм и интенсивностью света 25 мкВт/см 2 в течение 30–200 мс, и были получены изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразина-h или 3 мкМ фуримазина (Promega).Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Для уменьшения рассеянного света от микроскопа и окружающей среды во время BRET-изображения в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верхняя часть нагревателя предметного столика была покрыта алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. В работе использовались дихроичные зеркала и фильтры: дихроичное зеркало ФФ458-Ди02-25х36 для ЦФП и FRET, три эмиссионных фильтра (ФФ01-483/32-25 для ЦФП и голубого свечения, ФФ01-542/27-25 для ФРЭТ, YFP и желтая люминесценция и FF01-624/40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, штат Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Дихроичное зеркало не использовалось для визуализации BRET.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, France) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона были созданы изображения отношения FRET/CFP, которые были представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET/CFP, при этом интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP. Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума 53 . Затем были созданы изображения отношения желтого/голубого свечения таким же образом, как изображения отношения FRET/CFP. Изображения с двумя длинами волн, полученные при люминесцентной визуализации всего тела, были разделены между желтыми и голубыми люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нанофонаря и желтого нанофонаря были разделены путем линейного разделения.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x, и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3–8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразина-ч. Канал mCherry использовали для определения положений фокуса и стадии, чтобы не запускать мембранную транслокацию сигнальных молекул, слитых с CRY2. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт/см 2 ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и проводили люминесцентную визуализацию, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом с длиной волны 440 нм (200 или 450 мкВт/см 2 ) или светом с длиной волны 490 нм (180 мкВт/см 2 ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы для считывания микропланшетов

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток/лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разбавленным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 мин. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовали для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ целентеразина-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтую и голубую люминесценцию с помощью считывателя микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр с коротким проходом 495 нм использовался для голубого свечения, а фильтр с длиной волны 530 нм — для желтого свечения. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c–f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина/стрептомицина после прикрепления клеток к дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разбавленным гефитинибом в течение 1 дня. Циановую люминесценцию и желтую люминесценцию клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ коэлентеразина-h.{\prime} =1-\frac{3(S{D}_{AZD0}+S{D}_{AZD1})}{Av{e}_{AZD0}-Av{e}_{AZD1}} $$

(5)

Здесь SD — стандартное отклонение, а Ave — среднее значение желто-голубой люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или с 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее 26 . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $ $

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK представляет собой соотношение желтого/голубого свечения hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Формирование опухоли ксенотрансплантатом и создание трансгенных мышей

Самок мышей BALB/c nu/nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для формирования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 6 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нанофонарь и голубой нанофонарь в 50 мкл GelTrex/PBS (1:1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 5 клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS, в хвостовую вену и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенных мышей получали с помощью Tol2-опосредованного переноса генов 54 . Вкратце, в оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl:B6C3F1 (B57BL/6N Jcl X C3H/HeN Jcl), микроинъецировали смесь мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl:ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Токио) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через очки желтого цвета. Протоколы животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Высшей школы медицины Киотского университета (№10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), а методы осуществлялись в соответствии с соответствующими руководствами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения времени жизни биолюминесценции между аналогами коэлентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляция, 0,5 л/мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-ч (80 мкг на мышь) в этаноле/PBS (1:4) или диацетилкоэлентеразин-ч (80 мкг на мышь)/плюроник F-127 (20% мас./об. в ДМСО) (Biotium, Hayward , CA) (1:1) растворяли в PBS.Для люминесцентной визуализации мышей с метастазирующими опухолями (рис. 5a–j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляция, 0,5 л/мин) и внутривенно вводили смесь диацетилкоэлентеразина-h (200 мкг на мышь). ) и носитель или 5,0 мг/кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% вес/объем в ДМСО)/PBS (1:1) (общий объем составлял 100 мкл/мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляция, 0.5 л/мин) и вводили 1 мМ диацетилкоэлентеразина-h, растворенного в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. /об. в ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл/ч с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг/кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл/мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображения мышей получали с помощью устройства формирования изображений MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой с разделением изображения W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Миссисауга, Онтарио). ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программным обеспечением Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей анестезировали изофлураном и согревали пластиной для предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время экспозиции 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазирующих опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветной люминесцентной визуализации in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483/32-25 для голубой люминесценции и FF01-542/27- 25 для желтой люминесценции) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% при ингаляции, 0,5 л/мин). Часть кожи на левой стороне грудной клетки разрезали, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер 22-G SURFLO (Terumo, Токио). Затем мышей помещали в положение лежа на правом боку и резецировали левые ребра, обнажая левое легкое.Мышей немедленно подключали к аппарату искусственной вентиляции легких MK-V100 (Muromachi Kikai, Токио). До окончания визуализации дыхание обеспечивалось механически в следующих условиях: 55 уд/мин, 35 мл/мин, соотношение вдох/выдох 3:2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить двигательные артефакты, вызванные дыханием, открытую область левого легкого осторожно отсасывали и иммобилизовали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был соединен с вакуумным насосом. Опухоли в легком визуализировали с помощью прямого микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного 25-кратным иммерсионным объективом XLPlanN (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected. Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. Использовались дихроичные зеркала DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Использовались эмиссионные фильтры FF01-425/30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг/кг -1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Молекулярные детерминанты контактов ЭР–Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET–FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS, и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциирован с микротрубочками, а также с комплексом Гольджи (рис. 5А; Nissilä et al., 2012), и, не обладая каноническим доменом FFAT, может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Murphy and Левин, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, которое включает членов, которые могут передавать PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al., 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и экстрагирует PS (Maeda et al., 2013). Мы заметили, что остатки oxysterol-related domain (ORD) ORP5/ORP8, которые участвуют в обмене PS/PI4P (Chung et al., 2015), очень хорошо консервативны в ORP10 (Fig. 5B). Чтобы выяснить, связана ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS со структурной ролью или с его активностью по переносу липидов, устойчивый к siRNA ORP10 был реэкспрессирован в клетках с истощенным ORP10, как в его форме WT, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535/536A) было мутировано (фиг. 5 Б). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис. 5C), могут восстанавливать ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис. 5D и рис. S3, A и B). , что указывает на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащен в PM, TGN и эндосомах (Leventis, Grinstein, 2010; Fairn et al., 2011), где он асимметрично распределен между двуслойными листками, ограничиваясь цитозольным листком.Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на внутриклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающий домен лактадгерина (домен C2; Yeung et al., 2008; рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 вызывало снижение PS в аппарате Гольджи, что оценивалось по распределению двух зондов PS (рис. 5 E и рис. S3 C), которые показали заметное снижение пула Гольджи (но не пула PM) в клетках ORP10-KD, а также наблюдение, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD было сохранено. на PS-аффинных шариках по сравнению с контрольными клетками (рис. S3 D).

Таким образом, ORP10 требуется для защиты содержимого PS в TGN и, в то же время, ERTGoCS (рис. 4, A–F; рис. 5 E; и рис. S3, C и D), что указывает на то, что Липидный состав TGN и, в частности, его содержание PS имеют решающее значение для создания/поддержания этих структур.Подтверждая эту гипотезу, экзогенное добавление PS частично восстанавливало ERTGoCS в клетках с истощенным ORP10 (рис. 5 F). Аналогичные результаты были получены, когда продукция ФС была усилена за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы ФС-синтазы 1, нечувствительной к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Sohn et al., 2016; рис. 5G). и рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т. е. структурную роль в сравнении с ролью, зависящей от переноса липидов, в поддержании ERTGoCS) для OSBP1, который, как было установлено, является обязательным партнером ORP9 в поддержании ERTGoCS.С этой целью мы изучили влияние итраконазола, ингибитора активности липидного обмена OSBP1 (Strating et al., 2015), на стабильность ERTGoCS и обнаружили, что он не оказывает ингибирующего действия ни в контрольных клетках, ни в ORP9-KD. клетки (рис. 5 Н).

Визуализация митохондриального потока в отдельных клетках с помощью датчика FRET для пирувата

Abstract

Митохондриальный поток в настоящее время доступен с низким разрешением. Здесь мы представляем генетически закодированный датчик FRET для пирувата и методы количественного измерения транспорта пирувата, производства пирувата и потребления митохондриального пирувата в неповрежденных отдельных клетках с высоким временным разрешением.В клетках HEK293, нейронах и астроцитах митохондриальное поглощение пирувата было насыщено на физиологических уровнях, показывая, что скорость метаболизма определяется внутренними свойствами органеллы, а не доступностью субстрата. Потенциал сенсора был дополнительно продемонстрирован на нейронах, где было обнаружено, что митохондриальный поток увеличивается на 300% в течение нескольких секунд после перехода кальция, вызванного коротким тета-всплеском, в то время как уровень глюкозы оставался неизменным. Напротив, астроцитарные митохондрии были нечувствительны к аналогичному кальциевому переходному процессу, вызываемому внеклеточным АТФ.Мы ожидаем, что улучшенное разрешение, обеспечиваемое датчиком пирувата, будет представлять практический интерес для фундаментальных и прикладных исследователей, интересующихся функцией митохондрий.

Образец цитирования: Сан-Мартин А., Себальо С., Баэса-Ленерт Ф., Лерчунди Р., Вальдебенито Р., Контрерас-Баеза И. и др. (2014)Визуализация митохондриального потока в одиночных клетках с помощью датчика FRET для пирувата. ПЛОС ОДИН 9(1): е85780. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780

Редактор: Карл-Вильгельм Кох, Университет Ольденбурга, Германия

Поступила в редакцию: 20 сентября 2013 г. ; Принято: 5 декабря 2013 г.; Опубликовано: 21 января 2014 г.

Авторские права: © 2014 San Martin et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа частично финансировалась за счет совместного гранта CONICYT-Chile и Deutsche Forschungsgemeinschaft для Л. Фелипе Барроса и Йоахима В. Дейтмера (DFG-12, DE 231/25-1). Centro de Estudios Científicos (CEC) финансируется правительством Чили через Базовую программу финансирования центров передового опыта CONICYT.Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Митохондрии являются основными генераторами клеточного АТФ, а также важными местами деградации и синтеза метаболитов. Митохондрии участвуют в производстве и детоксикации активных форм кислорода, в регуляции передачи сигналов кальция, апоптоза, некроза и аутофагии, играя роль в дегенеративных заболеваниях и прогрессировании рака.Функцию митохондрий можно оценить с высоким разрешением с помощью флуоресцентной микроскопии путем оценки митохондриального кальция, потенциала, pH, аутофлуоресценции NAD(P)H и т. д. Однако эти параметры лишь косвенно связаны с митохондриальным метаболизмом и могут быть неоднозначными: например, , более высокая концентрация митохондриального кальция и митохондриальная деполяризация могут наблюдаться, когда клетки активны, но также и когда клетки умирают [1].

Скорость митохондриального метаболизма, т.е.е. скорость метаболизма обычно оценивается как скорость потребления кислорода, измеряемая в клеточных популяциях или очищенных митохондриях с помощью внеклеточных кислородных электродов или датчиков. В качестве альтернативы, митохондриальный метаболизм можно оценить с помощью изотопно-меченых метаболитов, которые обнаруживаются как CO 2 , высвобождаемых в среду, или посредством стационарного обогащения изотопной метки промежуточными метаболитами, которые могут быть обнаружены неинвазивно с помощью ЯМР. спектроскопия.Общим ограничением этих методов является потребность в клеточных популяциях, что затрудняет определение вклада отдельных типов клеток в сложные ткани, опухоли или клеточные культуры. Кроме того, некоторые существующие методы имеют низкое временное разрешение, что препятствует изучению быстрых метаболических явлений, которые, как считается, происходят в головном мозге. Многое из того, что известно о функциях и дисфункциях митохондрий, связано с изучением очищенных органелл [1], но митохондрии не работают изолированно, и известно, что их функция модулируется цитозольными молекулами и взаимодействиями с другими органеллами. теряются в процессе очистки.

В этой статье мы представляем метод оценки митохондриального потока в отдельных интактных клетках в режиме реального времени с использованием флуоресцентной микроскопии. Метод основан на новом генетически закодированном наносенсоре FRET для пирувата, который, кроме того, позволяет оценивать внутриклеточные уровни пирувата, клеточный транспорт пирувата и скорость гликолитического производства пирувата.

Результаты

PdhR, окруженный парой FRET, mTFP-Venus сообщает о концентрации пирувата

PdhR — бактериальный регулятор транскрипции, контролирующий экспрессию гена пируватдегидрогеназы в ответ на пируват [2].Чтобы создать наносенсор FRET для пирувата, PdhR из Escherichia coli (рис. 1A) был выбран в качестве каркасного белка и фланкирован флуоресцентными белками mTFP и Venus в качестве соответствующих донора и акцептора FRET (рис. 1B). Были построены четыре варианта гибридного белка с линкерами и без них. Соответствующие последовательности ДНК и аминокислот описаны на рисунке S1. Соотношение между интенсивностью флуоресценции mTFP и Венеры (R) измеряли в отсутствие и в присутствии 5 мМ пирувата.Зависимое от пирувата изменение соотношения (ΔR) четырех вариантов показано на рис. 1С. Вариант с наибольшим откликом был назван пироник (пируватный оптический наноиндикатор от ЦИК) и охарактеризован более подробно. Как показано на рис. 2А, воздействие пирувата на пироник вызывало увеличение интенсивности флуоресценции mTFP и снижение интенсивности флуоресценции Венеры, что согласуется со снижением эффективности FRET. Воздействие увеличивающихся концентраций пирувата показало, что Pyronic реагирует на пируват в диапазоне от 10 мкМ до 1 мМ, при этом K D составляет 107 ± 13 мкМ, а максимальное изменение коэффициента флуоресценции составляет приблизительно 20 % (рис.2Б). Этот K D в микромолярном диапазоне согласуется с анализами замедления гелеобразования с очищенным PdhR [2]. pH в физиологическом или патологическом диапазоне существенно не влиял на восприятие пирувата (рис. 2C). На датчик не влияли миллимолярные уровни лактата, ацетата, глутамата, бета-гидроксибутирата, глюкозы, альфа-оксоглутарата, сукцината или малата ни в отсутствие (рис. 2D), ни в присутствии пирувата (рис. 2E-F). Обнаружение пирувата было нечувствительным к окислительно-восстановительному отношению (рис.2Н). Небольшой эффект наблюдался для цитрата при 1 мМ, но не при 100 мкМ, концентрации, наблюдаемой в цитозоле млекопитающих [3]–[5] (рис. 2D и 2G). Оксалоацетат в концентрации 1 мМ вызывал небольшое изменение коэффициента флуоресценции, но не при концентрации 100 мкМ, что значительно выше низкого микромолярного уровня, присутствующего в клетках млекопитающих [3] (рис. 2D и 2F).

Рис. 1. Pyronic, датчик пирувата FRET на основе регулятора транскрипции PdhR.

A. 3D-структура PdhR из Escherichia coli , предсказанная по аналогии с LldR и FadR, (http://www.fiserlab.org/servers_table.htm). B. Конструкция сенсора: регулятор транскрипции PdhR был помещен между флуоресцентными белками mTFP (донор FRET) и Venus (акцептор FRET) с синтетическими пептидами, разделяющими белки (синий и оранжевый линкеры). C. Влияние 5 мМ пирувата на коэффициент флуоресценции четырех вариантов пируватного сенсора. Наиболее чувствительная из конструкций (стрелка) была названа пироновой и использовалась для дальнейшей характеристики и измерений клеток.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0085780.g001

Рисунок 2. Характеристика Pyronic in vitro.

A. Спектры излучения в отсутствие и в присутствии 1 (при возбуждении 462 нм) измеряли при возрастающих концентрациях пирувата. Непрерывная линия соответствует наилучшему соответствию прямоугольной гиперболы данным с кажущимся значением константы диссоциации (K D ) 107 ± 13 мкМ и максимальным изменением коэффициента флуоресценции (ΔRmax) 24 ± 0,7%. C. Кривые доза-реакция пирувата были измерены при указанных значениях pH.Сплошная линия показывает наилучшее соответствие прямоугольной гиперболы данным при рН 7,2. D. Реакция Pyronic на панель метаболитов в концентрации 1 мМ, если не указано иное. Э-Ф-Г. Кривые реакции на дозу пирувата измеряли в отсутствие и в присутствии панели метаболитов при концентрации 1 мМ, если не указано иное. Показаны наилучшие соответствия прямоугольных гипербол контрольным данным. H. Кривые реакции на дозу пирувата измеряли в восстановленной среде (0,2 мкМ НАДН), окисленной среде (100 мкМ НАД + ) или промежуточной среде (0.2 мкМ НАДН плюс 100 мкМ НАД + ). Показано наилучшее соответствие прямоугольной гиперболы последней.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.g002

Pyronic сообщает о цитозольных концентрациях пирувата в клетках млекопитающих

Экспрессированный в клетках HEK293, нейронах и астроцитах Pyronic показал ожидаемое цитозольное распределение (фиг. 3A). Отмечалась быстрая реакция на изменения внеклеточного пирувата, достигавшая насыщения в миллимолярном диапазоне (рис.3Б). Максимальное изменение коэффициента флуоресценции сенсора, выраженного в клетках, составило около 40%, что вдвое больше, чем наблюдаемое in vitro (см. рис. 2), явление, ранее отмеченное для структурно родственного лактатного наносенсора [6]. Коэффициент флуоресценции не реагировал на удаление внеклеточной глюкозы (рис. S2A), что указывает на то, что в отсутствие внеклеточного пирувата цитозольный пируват находится ниже диапазона обнаружения датчика (т.е. <10 мкМ, см. рис. 2). Это низкое содержание пирувата в цитозоле согласуется с низким внутриклеточным лактатом, измеренным в культивируемых клетках в тех же условиях [6], и может быть объяснено потерей пирувата и лактата через высокопроницаемые монокарбоцилатные транспортеры (MCT).Экспрессия в зрелых астроцитах гиппокампа путем стереотаксической инъекции специфического для астроцитов аденовирусного вектора с последующим приготовлением острых срезов ткани выявила типичный фрактальный аспект протоплазматических астроцитов, обнаруженный in situ (рис. 3C). В отличие от астроцитов в культуре, in situ астроцитов показали снижение цитозольного пирувата при удалении внеклеточной глюкозы (рис. 3D). Это открытие можно объяснить наличием MCT4 в зрелых астроцитах [7], изоформы, которая имеет гораздо более низкое сродство к пирувату, чем MCT1, изоформа, обнаруженная в астроцитах в культуре [8]-[10]. Соответственно, астроциты in situ были намного медленнее, чем культивируемые астроциты, при поглощении и высвобождении пирувата (рис. 3D). Предостережение заключается в том, что аденовирусные векторы могут вызывать местное воспаление при использовании in vivo . Вместо этого для систематического исследования сенсор может быть экспрессирован с помощью аденоассоциированных вирусных векторов или трансгенеза. Если это подтвердится, существование у взрослых астроцитов проницаемости для пирувата подтвердит гипотезу о том, что астроциты переносят энергию к нейронам, экспортируя лактат в обмен на пируват [11], [12].Как и ожидалось при острой стимуляции гликолиза [13] и продукции лактата [6], взрослые астроциты быстро заполняются пируватом после митохондриального ингибирования комплексом IV блокатора азида натрия (рис. 3D).

Рисунок 3. Визуализация пирувата в клетках млекопитающих.

A. Распределение Pyronic в клетках HEK293, астроцитах и ​​нейронах в культуре. Масштабные полосы представляют 20 мкм. B. Реакция коэффициента флуоресценции на импульсы 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 и 1 мМ пирувата в клетках HEK293. С.Распределение Пироника в протоплазматических астроцитах среза гиппокампа. Бар представляет 20 мкм. D. Реакция астроцита, отмеченного стрелкой C, на истощение глюкозы, импульсы 10 мМ пирувата и воздействие 5 мМ азида натрия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.g003

Воспользовавшись возможностью измерения крайних точек кривой насыщения в каждой ячейке путем последовательных инкубаций с пируватом и без него, датчик был откалиброван с использованием значение K D оценено in vitro , согласно уравнению пирувата (мМ)  =  (0.107*ΔR)/(ΔRmax – ΔR). На рисунке S2B показан пример преобразования данных отношения флуоресценции в концентрацию пирувата с использованием этого протокола двухточечной калибровки. Подтверждая предыдущие результаты с лактатным наносенсором FRET [6], поглощение пирувата клетками HEK293 было полностью ингибировано специфическим ингибитором МСТ AR-C155858 и частично неспецифическим ингибитором МСТ флоретином (рис. S3). Таким образом, AR-C155858 был выбран в качестве предпочтительного блокатора MCT для описанных ниже протоколов остановки ингибиторов.

Производство гликолитического пирувата

Внутриклеточная концентрация пирувата определяется динамическим балансом между продукцией пирувата путем гликолиза и потреблением пирувата митохондриями, ЛДГ и МСТ (рис. 4А). Ингибирование оттока пирувата и лактата с помощью блокатора МСТ AR-C155858 в присутствии глюкозы приводило к прогрессирующему накоплению внутриклеточного пирувата, которое ингибировалось депривацией глюкозы (рис. 4В-С), подтверждая гликолитическое происхождение пирувата.Таким образом, этот протокол остановки ингибитора обеспечивает стратегию оценки гликолиза в точке его выхода. В соответствии с временной зависимостью блокировки MCT, описанной ранее [14], наблюдалась задержка около 2 минут между применением AR-C155858 и началом накопления пирувата.

Рисунок 4. Оценка гликолитических и митохондриальных потоков.

A. Цитозольный пул пирувата определяется гликолитической продукцией, потреблением митохондриями и преобразованием в лактат, который затем покидает клетку через МСТ.Незначительное количество пирувата также может быть потеряно через МСТ. Б. Накопление пирувата в клетке НЕК293, подвергнутой воздействию блокатора МСТ AR-C155858 (1 мкМ) в присутствии 2 мМ глюкозы (контроль) или в клетке, лишенной глюкозы, в течение 30 мин. C. Влияние увеличения времени депривации глюкозы на скорость накопления пирувата, индуцированного 1 мкМ AR-C155858 в клетках HEK293. D. При использовании пирувата в качестве исключительного топлива цитозольный пул пирувата определяется только притоком через МСТ и потреблением митохондриями.E. Клетки HEK293 истощали по глюкозе в течение 1 часа, а затем подвергали воздействию 0,3 мМ пирувата в отсутствие (контроль) или в присутствии 5 мМ азида натрия. Добавление 1 мкМ AR-C155858 приводило к снижению внутриклеточной концентрации пирувата только в контрольной клетке. F. Резюме влияния 5 мМ азида натрия на скорость потребления митохондриального пирувата, измеренное, как описано в E.

.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.g004

Измерение потребления митохондриями пирувата

Чтобы оценить митохондриальный поток, клетки HEK293, экспрессирующие Pyronic, сначала истощали глюкозу в течение 1 часа, состояние, при котором гликолитическая продукция пирувата незначительна (рис.4С). Воздействие пирувата на клетки, лишенные глюкозы, приводило к более простому динамическому равновесию между притоком из внеклеточного пространства через МСТ и клиренсом из-за потребления митохондриями пирувата (рис. 4D). Мы наблюдали, что внутриклеточный пируват стабилизировался на уровне около 30-50% от внеклеточного пирувата. Например, в клетках, показанных на фиг. 4Е, погруженных в 0,3 мМ пируват, внутриклеточное содержание пирувата колебалось около 0,1 мМ. Прерывание стационарного состояния за счет блокирования МСТ приводило к устойчивому снижению цитозольного пирувата до полного истощения пула. Скорость клиренса пирувата была постоянной в большей части диапазона концентраций, что делало очевидным насыщение переносчиков пирувата (рис. 4Е). Ингибирование митохондриального окислительного фосфорилирования азидом натрия блокирует клиренс пирувата (рис. 4E-F), подтверждая, что этот клиренс обусловлен митохондриальным метаболизмом.

Модуляция митохондриального потока в интактных клетках головного мозга

Высокое пространственное и временное разрешение, обеспечиваемое флуоресцентной микроскопией, использовалось для поиска быстрых метаболических событий в смешанных культурах нейронов и астроцитов, в условиях, в которых оба типа клеток дифференцируются лучше всего, как морфологически, так и метаболически [15].Прежде всего, культуры стимулировали полем с помощью короткого тета-всплеска, протокола, который имитирует умеренные уровни активности гиппокампа [16]. Эффективность тета-всплеска для активации нейронов была подтверждена сильным кальциевым переходным процессом (рис. 5А). Измерение с помощью наносенсора глюкозы [17] не показало изменений в нейрональном пуле глюкозы во время или после тета-всплеска (рис. 5В), который, как известно, быстро мобилизуется в ответ на изменение рН [18]. Напротив, датчик пирувата показал, что в течение нескольких секунд после первой последовательности импульсов скорость митохондриального метаболизма в нейронах увеличилась более чем на 300% (рис.5С и 5D). В астроцитах базальная скорость потребления митохондриального пирувата была ниже, чем в нейронах, и не стимулировалась большим переходным процессом кальция, вызванным внеклеточным АТФ (рис. 5E и 5F). Контрольные эксперименты показали, что 1 мкМ AR-C155858 ингибировал нейрональный и астроцитарный транспорт пирувата более чем на 95% (данные не показаны). Как и в случае с клетками HEK293, клиренс пирувата как в астроцитах, так и в нейронах был линейным при низких уровнях пирувата (рис. 5C и 5E), демонстрируя высокоаффинное поглощение пирувата митохондриями.Диссоциация между метаболизмом пирувата и глюкозы в первые моменты активации подтверждает представление о том, что активные нейроны преимущественно заряжаются лактатом, а не глюкозой [19]. Отсутствие реакции астроцитарных митохондрий показывает, что кальциевый сигнал недостаточен для стимуляции митохондриального метаболизма, и предполагает, что астроциты могут не вносить значительного вклада в падение уровня кислорода, которое следует за активацией мозга.

Рисунок 5. Ранние метаболические события во время активации клеток головного мозга.

A. Нагруженные Fluo-4 нейроны гиппокампа стимулировали тета-всплесками, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные являются средними для 8 ячеек. B. Влияние тета-всплеска на внутриклеточную глюкозу в 3 нейронах. Столбцы иллюстрируют данные из 8 клеток в трех экспериментах. C. Влияние тета-всплеска на скорость потребления митохондриями пирувата в нейроне, измеренное в присутствии 0,4 мМ пирувата и 1 мкМ AR-C155858. D. Объединенные данные от 9 нейронов в пяти экспериментах, подобных показанному на C. Столбцы суммируют частоты в 30-секундные периоды до и после тета-всплеска.E. Влияние 5 мкМ АТФ на потребление митохондриями пирувата в астроцитах, измеренное в присутствии 0,4 мМ пирувата и 1 мкМ AR-C155858. Также показан ответ кальция на 5 мкМ АТФ в отдельном эксперименте. Данные являются средними из 8 ячеек. F. Объединенные данные о пирувате из 40 астроцитов в эксперименте, подобном показанному на E. Бары суммируют скорости за 2 минуты до и после применения АТФ в 40 клетках в пяти экспериментах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.g005

Обсуждение

Митохондрии — это интересно. Динамика деления-слияния, динамика кальция, апоптоз, аутофагия, взаимодействие с эндоплазматическим ретикулумом, роль в развитии рака и дегенеративных заболеваний и так далее. Многие из этих процессов можно проследить в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии, но нет практического аналога основной биологической функции митохондрий — метаболизму. Здесь мы представляем метод, который количественно митохондриальный метаболизм в неповрежденных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии.

Датчик пирувата реагировал на пируват в диапазоне от 10 мкМ до 1 мМ, охватывающий физиологический диапазон, измеренный в плазме и тканях млекопитающих, и было показано, что он нечувствителен к pH, окислительно-восстановительному отношению и к нескольким близкородственным цитозольным и митохондриальным метаболитам. Пироник может быть добавлен к появляющемуся списку сенсоров флуоресцентных метаболитов, которые были проверены в клетках млекопитающих, включая зонды для глюкозы [17], АТФ [20], [21], НАДН/НАД + [12], [22]. ] и лактат [6].Одной из положительных характеристик, связанных с Pyronic, является то, что он делает возможной неинвазивную калибровку, которая позволяет оценивать концентрацию в каждом эксперименте, не прибегая к жестким процедурам пермеабилизации клеток. Важной характеристикой сенсора пирувата является то, что его можно комбинировать с транспортными блокаторами для получения количественных оценок метаболического потока.

Золотым стандартом митохондриальной функции является респирометрия, метод, давно используемый для исследования клеток в суспензии и изолированных митохондрий.Недавно было введено успешное усовершенствование респирометрии для адгезивных клеток в многолуночном формате [23]. Сенсор пирувата также измеряет скорость митохондрий, но отличается от респирометрии объемом, сильными сторонами и ограничениями. Респирометрия измеряет скорость митохондрий независимо от фактического метаболизируемого субстрата, т.е. пируват, жирные кислоты, кетоны и т. д., в то время как текущий метод специфичен для пирувата. Это ограничение может быть полезно для изучения митохондриального переносчика пирувата MPC [24], [25], который недавно был идентифицирован как мишень для тиазолидиндионов, основного класса гипогликемических препаратов [26].В клетках, экспрессирующих анаплеротический фермент пируваткарбоксилазу, наносенсор будет сообщать о сумме потоков через пируватдегидрогеназу и через пируваткарбоксилазу, пути, которые могут быть дополнительно разделены с помощью ингибиторов фермента и/или методов нокдауна. Нормальные и больные ткани гетерогенны с точки зрения экспрессии и распределения метаболических ферментов [27], что подразумевает специфические концентрации и потоки метаболизма клеток. Отличительным преимуществом пируватного наносенсора является то, что он обеспечивает разрешение отдельных клеток, предоставляя доступ к определенным типам клеток в сложных культурах и тканях. Даже в популяциях моноклональных клеток, культивируемых в идентичных условиях, существует регулируемая межклеточная изменчивость, которую можно использовать для открытия новых молекулярных механизмов [28]. Еще одним преимуществом является высокое временное разрешение, дающее доступ к быстрым явлениям. Эти две особенности были объединены в нашем исследовании с обнаружением быстрых метаболических событий в зрелых нейронах в присутствии астроцитов. Общее ограничение настоящего метода заключается в том, что датчик необходимо вводить в клетки, что делает его непрактичным для изучения свежевыделенных клеток или тканей в клиническом контексте, что легко происходит при респирометрии.Конкретным ограничением измерения митохондриального потока является то, что оно требует отсутствия глюкозы, фактора, который может повлиять на функцию митохондрий. В целом метод сенсора пирувата и респирометрия кажутся взаимодополняющими, поскольку они исследуют отдельные аспекты митохондриальной функции и имеют разные ограничения.

Потенциал датчика для решения конкретных вопросов был проиллюстрирован с использованием клеток HEK293, астроцитов и нейронов. Фундаментальная проблема биоэнергетики связана с управлением митохондриальным метаболизмом.Эксперименты в изолированных митохондриях выявили несколько кандидатов, включая цитозольный Ca 2+ , митохондриальный Ca 2+ , соотношение АТФ/АДФ, доступность пирувата и активность митохондриального переносчика пирувата [1], [24], [25]. ], [29], [30]. Постоянство скорости клиренса пирувата, которое мы наблюдали, показывает, что митохондриальные переносчики пирувата насыщены физиологическими уровнями пирувата, и что доступность пирувата не ограничивает скорость и вряд ли может контролировать митохондриальный метаболизм в интактных клетках.Это важное наблюдение, так как в литературе нет единого мнения о сродстве митохондрий к пирувату. Измерения в изолированных органеллах позволили оценить значения K m для митохондриального поглощения пирувата на расстоянии 5 мкм и 1 мМ [31]–[33]. В мозге есть и другие вопросы, требующие решения, например, насколько быстро митохондрии реагируют на потребность в энергии и какова относительная роль нейронов и астроцитов. В астроцитах мы обнаружили, что значительный переходный процесс кальция, вызванный АТФ, не смог стимулировать митохондриальный поток, в то время как аналогичный переходный процесс кальция, вызванный в нейронах умеренной электрической стимуляцией, вызвал сильную стимуляцию потребления пирувата в течение нескольких секунд.Электростимуляция не влияла на уровень глюкозы. Специфическое измерение потребления глюкозы отдельными нейронами с помощью датчика глюкозы FRET [13] может помочь разделить возможные вклады транспорта и метаболизма глюкозы. Наши результаты важны по нескольким причинам: они подразумевают, что нейроны ответственны за резкое падение концентрации кислорода, которое следует за нервной активацией in situ ; они обеспечивают метаболическое объяснение выброса митохондриальной флуоресценции NAD(P)H, который следует за активацией нейронов [34]; и они показывают, что активные нейроны претерпевают существенное увеличение митохондриального потока пирувата без видимых изменений в метаболизме глюкозы, оставляя лактат в качестве основного источника энергии для активных нейронов [19], [35]. Отсутствие ответа в астроцитах подтверждает роль митохондриально-специфических факторов, обуславливающих реакцию на кальций, таких как митохондриальные переносчики аралар и цитрин [30]. Дальнейшее понимание краткосрочной регуляции митохондриального потока сигналами кальция в нейронах и астроцитах может потребовать более детальной характеристики, включая кривые доза-реакция, использование фармакологических блокаторов и агонистов рецепторов, а также количественное определение кальция с помощью ратиометрических красителей. Значительная проницаемость пирувата, обнаруженная в астроцитах в срезах гиппокампа, стала неожиданностью, поскольку изоформа MCT, присутствующая в астроцитах (MCT4), проявляла чрезвычайно низкое сродство к пирувату при экспрессии в ооцитах [8], [9].В то время как природа пируватного пути в зрелых астроцитах еще предстоит исследовать, его присутствие обеспечивает недостающее звено для предполагаемого окислительно-восстановительного конвейера астроцитов-нейронов [11], [12].

Наш датчик пирувата также может представлять интерес для биотехнологии, области исследований, требующей методов с высоким разрешением [36]. Пируват является метаболическим узлом, расположенным на перекрестке гликолиза и митохондриального метаболизма, и является исходным метаболитом для многих путей клеточного биосинтеза.Пируват представляет собой молекулу, представляющую промышленный интерес, поскольку в настоящее время он производится в качестве пищевой добавки, добавки для контроля веса и антиоксиданта, а также в качестве сырья, широко применяемого в химической, фармацевтической и агрохимической промышленности. Стандартные методы измерения пирувата основаны на ферментативных реакциях, которые контролируются с помощью фотометрических, амперометрических, ВЭЖХ и других методов. Относительные преимущества сенсора в этом плане заключаются в том, что он не потребляет пируват и не требует разрушения образца.Он также чувствителен, поскольку на сегодняшний день является единственным методом, способным обнаруживать незначительные количества пирувата, присутствующего в одной клетке. Будучи генетически закодированным, датчик пирувата может производиться бактериями в больших количествах по низкой цене.

Таким образом, мы представили здесь генетически закодированный датчик FRET для пирувата, а также методы количественной оценки концентрации пирувата, транспорта пирувата, производства пирувата и потребления митохондриями пирувата в интактных одиночных клетках.Демонстрируя свой потенциал, эти методы показали, что астроциты обладают значительной поверхностной проницаемостью для пирувата, что митохондрии не ограничены доступностью субстрата и что переход кальция быстро сопровождается активацией митохондриального потока в нейронах, но не в астроцитах. Мы ожидаем, что эти методы будут представлять большой практический интерес.

Материалы и методы

Стандартные реагенты и ингибиторы были приобретены у Sigma. AR-C155858 был приобретен у Haoyuan Chemexpress (Шанхай).

Конструкция датчика пирувата

Бактериальную геномную ДНК выделяли с использованием набора для выделения EZNA (Omega bio-tek). Ген PdhR из штамма E. coli был амплифицирован специфическими праймерами. Чтобы упростить стратегию клонирования, сайт HindIII был удален путем введения молчащей мутации из одного нуклеотида. Для легкого субклонирования последовательностей PhdR сайты рестрикции AflII и KpnI вводили соответственно на 3′- и 5′-конце ампликона. Реакции ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы горячего старта KOD (Novagen), а их продукты проверяли секвенированием (Macrogen.Инк). Четыре варианта сенсора пирувата были созданы с использованием технологии рекомбинационного клонирования Gateway® (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, были сконструированы два плазмидных вектора: целевой вектор и входной вектор. Вектор назначения (pDEST01) включал скелетный вектор pRSET-B, в котором последовательности ДНК, кодирующие полигистидиновый хвост, mTFP и Venus, были клонированы ниже бактериального промотора Т7. Кассету рекомбинации, амплифицированную из pDEST14 с помощью ПЦР, вставляли между последовательностями mTFP и Venus. Вектор входа был сконструирован с использованием вектора pCR®8/GW/TOPO TA путем клонирования последовательностей, соответствующих полному PdhR из E. coli (pENTPdhR01). Наконец, четыре вектора экспрессии были созданы с помощью реакции рекомбинации LR между вектором назначения pDEST01 и вектором входа pENTPdhR01 с последующим условным удалением линкера между mTFP и PdhR или линкера между PdhR и Venus путем расщепления векторов экспрессии рестрикционными ферментами. KpnI и AflII.

Очистка белков

Четыре варианта сенсора пирувата были преобразованы в компетентные штаммы E. coli BL21 (DE3). Одну колонию инокулировали в 100 мл среды LB с 100 мг/мл ампициллина (без ИПТГ) и встряхивали в темноте в течение 2–3 дней. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин (4°С) в течение 10 мин и разрушали ультразвуком (ультразвуковая технология Хильшера) в 5 мл трис-HCl-буфера с рН 8,0. Бесклеточный экстракт получали центрифугированием при 10000 об/мин (4°С) в течение 1 часа и последующей фильтрацией надосадочной жидкости (0. 45 мкм). Белки очищали с использованием никелевой смолы (His Bin® от Novagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Элюированные белки инкубировали в течение ночи при 4°С, количественно определяли биуретовым методом и хранили при -20°С в 20% глицерине. Вариант, который показал наибольшее изменение коэффициента флуоресценции, который мы назвали Pyronic (пируватный оптический наноиндикатор из CEC), был клонирован в pcDNA3.1(-) для экспрессии в эукариотических клетках с использованием сайтов рестрикции BamHI и HindIII.

Животные и клеточные культуры

Смешанные самцы мышей F1 (C57BL/6J x CBA/J, культуры) или sv/129 (стереотаксис) содержались в помещении для животных в условиях отсутствия специфических патогенов (SPF) при комнатной температуре 20±2°C, в 12/12-часовой цикл свет/темнота со свободным доступом к пище и воде.Процедуры были одобрены Centro de Estudios Científicos Комитетом по уходу и использованию животных. Смешанные культуры коры (1–3-дневные новорожденные) и культуры гиппокампа (17,5-дневные эмбрионы) готовили, как подробно описано ранее [13]. Астроциты в культурах коры использовали на 7-10-е сутки, а нейроны в культурах гиппокампа использовали на 14-17-е сутки. Клетки HEK293 были получены из Американской коллекции типовых культур и культивированы при 37°C в 95% воздухе/5% CO 2 в DMEM/F12 10% фетальной бычьей сыворотке.Культуры трансфицировали при 60% слиянии с использованием Lipofectamine 2000 (Gibco) или, альтернативно, подвергали воздействию 5×10 6 БОЕ Ad Pyronic или Ad FLII 12 Pglu600 µΔ6 (серотип 5, изготовленный на заказ Vector Biolabs) и исследовали после 24–72 ч.

Стереотаксис и подготовка острых срезов гиппокампа

Двухмесячных животных-самцов мышей Sv/129 анестезировали в стерильных условиях внутрибрюшинной инъекцией 2% авертина и закрепляли в стереотаксической рамке (Just for Mice™, Stoelting 51725).Температуру тела поддерживали на уровне 37°С с помощью регулятора температуры АТС (World Precision Instruments). После бритья кожу анестезировали 4% раствором лидокаина и разрезали ножницами. С помощью микродрель (Fine Science Tools) в черепе было сделано круглое отверстие диаметром 0,3 мм. Кончик иглы 34G, соединенной со шприцем Hamilton полиэтиленовым катетером, помещали в гиппокамп, на 2 мм кзади от брегмы, на 1,5 мм медиолатеральнее и на 1,8 мм ниже поверхности пиала. рекламный пироник (1.85×10 6 БОЕ, разведенных в 2 мкл буфера PBS с добавлением 1% BSA), вводили с помощью шприцевого насоса Fusion 100 (Chemyx Inc.). После извлечения иглы кожу анестезировали 4% раствором лидокаина и накладывали швы. Через 3–4 недели срезы гиппокампа готовили следующим образом. Животных умерщвляли путем смещения шейных позвонков, удаляли голову и осторожно извлекали головной мозг. Коронарные срезы мозга толщиной 200 мкм готовили с использованием вибратома (1000 Plus Sectioning System, Vibratome®).Во время срезов мозг хранили в холодном буфере (мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4 , 26 NaHCO 3 , MgCl 2 , 0,5 CaCl 7 и 0,5 CaCl 7 2. ) газированный 95% O 2 /5% CO 2 , pH 7,4. Срезы гиппокампа переносили во второй буфер (мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4 , 26 NaHCO 3 , 1 MgCl 2 , 1,5 CaCl 7 2, 1,5 лактат CaCl 7 2. глюкоза) газированная 95% O 2 /5% CO 2 , pH 7.4, при комнатной температуре. Во время экспериментов срезы были суперфузированы 95% O 2 /5% CO 2 -газированным буфером KRH (мМ): 126 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4 , 1,25 CaCl 0 2 . , 1,25 MgCl 2 , 10 глюкоза и 26 NaHCO 3 , pH 7,4.

Измерения флуоресценции

Белки

, очищенные от никеля, ресуспендировали в концентрации 100 нМ во внутриклеточном буфере, содержащем (мМ): 10 NaCl, 130 KCl, 1,25 MgSO 4 и 10 HEPES, pH 7.0, и измеряли с помощью анализатора для считывания микропланшетов (EnVision, PerkinElmer). Белки возбуждали при 430 нм и регистрировали интенсивность флуоресцентного излучения mTFP и Venus при 485 нм и 528 нм соответственно. Соотношение между выбросами использовалось для характеристики датчиков. Спектры испускания были получены при возбуждении 430 нм с окнами 2 нм. Клетки визуализировали при комнатной температуре (22-25°C) в 95% воздуха/5% CO 2 газированного KRH-бикарбонатного буфера следующего состава (в мМ): 112 NaCl, 1.25 CaCl 2 , 1,25 MgSO 4 , 1-2 глюкозы, 10 HEPES, 24 NaHCO 3 , pH 7,4, с 3 мМ KCl (клетки головного мозга) или 5 мМ KCl (HEK293) с использованием вертикального конфокатора Olympus FV1000 микроскоп с 20-кратным иммерсионным объективом (числовая апертура 1,0) и твердотельным лазером с длиной волны 440 нм. В качестве альтернативы клетки визуализировали с помощью микроскопа Olympus IX70 или Olympus BX51, оснащенного масляным иммерсионным объективом 40X (NA 1,3) или 20X иммерсионным объективом с водой (NA 0,95). Микроскопы были оснащены монохроматорами Cairn (Faversham, UK) и либо камерой Hamamatsu Orca, управляемой программным обеспечением Kinetics, либо камерой Rollera, управляемой программным обеспечением Metafluor, соответственно. Для измерения соотношения наносенсоров клетки возбуждали при 430 нм в течение 0,2–0,8 с. Эмиссия была разделена с помощью Cairn Optosplit, оснащенного полосовыми фильтрами при 480±20 (mTFP) и 535±15 нм (Venus). Соотношение между mTFP и Venus использовалось для оценки концентрации пирувата в соответствии с процедурой калибровки, описанной в разделе «Результаты» (рис. S2). Концентрацию внутриклеточной глюкозы измеряли наносенсором FRET FLII 12 glu700 µΔ6, имеющим К D для глюкозы 660±160 [17].

Электростимуляция

Смешанные культуры нейронов гиппокампа и астроцитов, выращенные на покровных стеклах диаметром 25 мм, стимулировали полем с использованием камеры RC-21BRFS (Warner Instruments) и устройства WPI PRO-4. Импульсы (выход 50 мА) генерировали с помощью сильноточного изолятора стимула WPI A385, подключенного к зарядному устройству батареи WPI A382. Протокол стимуляции, показанный на рис. 5А, представлял собой короткий тета-всплеск, протокол, который имитирует умеренную активность гиппокампа [16]. Он состоит из двух серий импульсов, разделенных 10 секундами.Каждая последовательность длится 1 секунду и состоит из двадцати импульсов длительностью 1 мс, распределенных на пять групп по четыре импульса.

Измерение кальция

Цитозольный кальций оценивали с помощью Fluo-4 (Invitrogen). Краситель загружали в АМ-форме (4 мкМ) на 30 минут при 37°С в буфере KRH без бикарбоната с добавлением 2 мМ глюкозы и 1 мМ лактата. После загрузки культуры переносили в стандартный KRH-бикарбонатный буфер и оставляли в покое еще на 15 мин перед измерениями.

Статистический анализ

Если не указано иное, эксперименты повторяли от трех до пяти раз с 6–12 клетками в эксперименте. Столбики погрешностей представляют SEM. Регрессионный и статистический анализы проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot (Jandel). Различия в средних значениях парных выборок оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между более чем двумя группами оценивали с помощью однофакторного анализа дисперсии Крускала-Уоллиса по рангам с последующим тестом Даннса.Значения P <0,05 считались значимыми и отмечены звездочкой (*).

Дополнительная информация

Рисунок S2.

Относится к Рис. 2 . Двухточечная калибровка Pyronic в ячейках HEK293. A. Удаление глюкозы и лактата не оказало заметного влияния на коэффициент флуоресценции Pyronic, что указывает на то, что уровни пирувата в покое ниже чувствительности сенсора (т.е. <10 мкМ). Показана реакция на 1 мМ пирувата.Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего по 8 ячейкам. B. На клетку последовательно воздействовали 1 мМ и 0,4 мМ пирувата. Нижняя панель показывает соотношение флуоресценции, где R 0 представляет собой отношение в отсутствие пирувата, а ΔR max представляет собой разницу между R 0 и максимальным соотношением, оцененным в 1 мМ пирувата. Значение отношения в каждый момент времени за вычетом R 0 , ΔR, было преобразовано в концентрацию пирувата (мМ, верхняя панель) с использованием измеренного ΔR max и K D , рассчитанного in vitro (107 мкМ, см. рис.2Б).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.s002

(DOC)

Рисунок S3.

Относится к Рис. 4 . Ингибирование транспорта пирувата в клетках HEK293. A. Динамика коэффициента флуоресценции Pyronic во времени в одной клетке, последовательно подвергавшейся воздействию 1 мМ пирувата, 1 мМ пирувата в присутствии 50 мкМ флоретина (5 мин предварительной инкубации) и 1 мМ пирувата в присутствии 1 мкМ AR-C155858. (5 мин преинкубации). Б.Те же данные, что и в А, выраженные в виде концентрации пирувата. C. Сводка по 24 клеткам в трех отдельных экспериментах. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085780.s003

(DOC)

Благодарности

Мы благодарим доктора Карен Эверетт за критическое прочтение рукописи.

Авторские взносы

Задумал и спроектировал эксперименты: ASM SC LFB. Выполнены эксперименты: АСМ КА ФБ РЛ РВ ЮЦ КА. Проанализированы данные: ASM SC FB RL RV YC KA LFB.Написал статью: ASM LFB.

Каталожные номера

  1. 1. Brand MD, Nicholls DG (2011)Оценка митохондриальной дисфункции в клетках. Biochem J 435: 297–312 BJ20110162 [pii]; 10.1042/BJ20110162 [doi].
  2. 2. Quail MA, Guest JR (1995)Очистка, характеристика и способ действия PdhR, репрессора транскрипции оперона pdhR-aceEF-lpd Escherichia coli. Мол микробиол 15: 519–529.
  3. 3. Siess EA, Brocks DG, Wieland OH (1978)Распределение метаболитов между цитозольным и митохондриальным компартментами гепатоцитов, выделенных у накормленных крыс.Hoppe Seylers Z Physiol Chem 359: 785–798.
  4. 4. Кауппинен Р.А., Хилтунен Дж.К., Хассинен И.Е. (1982)Компартментация цитрата в отношении регуляции гликолиза и градиента электрохимического потенциала митохондриального трансмембранного протона в изолированном перфузируемом сердце крысы. Биохим Биофиз Acta 681: : 286–291. 0005-2728(82)-0 [pii].
  5. 5. Саха А.К., Лейбатт Д.Р., Дин Д., Ваввас Д., Себокова Е. и соавт. (1999) Регуляция цитозольного цитрата и малонил-КоА в мышцах крыс in vivo.Am J Physiol 276: E1030–E1037.
  6. 6. Сан-Мартин А., Себальо С., Руминот И., Лерчунди Р., Фроммер В.Б. и др. (2013)Генетически закодированный датчик лактата FRET и его использование для обнаружения эффекта Варбурга в одиночных раковых клетках. PLoS ONE 8: e57712
  7. 7. Lee Y, Morrison BM, Li Y, Lengacher S, Farah MH, et al. (2012) Олигодендроглии метаболически поддерживают аксоны и способствуют нейродегенерации. Nature 487: 443–448 nature11314 [pii]; 10.1038/nature11314 [doi].
  8. 8.Диммер К.С., Фридрих Б., Ланг Ф., Дейтмер Дж.В., Броер С. (2000)Низкоаффинный переносчик монокарбоксилата МСТ4 приспособлен к экспорту лактата в высокогликолитических клетках. Biochem J 350 Pt 1: 219–27 .: 219–227.
  9. 9. Manning Fox JE, Meredith D, Halestrap AP (2000) Характеристика переносчика монокарбоксилатов человека 4 подтверждает его роль в оттоке молочной кислоты из скелетных мышц. J Physiol 529 Pt 2:: 285–293. PHY_1092 [pii].
  10. 10. Баррос Л.Ф., Дейтмер Дж.В. (2010)Поставка глюкозы и лактата в синапс.Brain Res Rev 63: 149–159.
  11. 11. Сердан С., Родригес Т.Б., Сьерра А., Бенито М., Фонсека Л.Л. и др. (2006) Гипотеза окислительно-восстановительного переключения / окислительно-восстановительного соединения. Нейрохим Инт 48: 523–530.
  12. 12. Хунг Ю.П., Альбек Дж.Г., Тантама М., Йеллен Г. (2011)Визуализация цитозольного окислительно-восстановительного состояния НАДН-НАД(+) с помощью генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора. Cell Metab 14: 545–554 S1550-4131(11)00342-1 [pii];10.1016/j.cmet.2011.08.012 [doi].
  13. 13. Bittner CX, Loaiza A, Ruminot I, Larenas V, Sotelo-Hitschfeld T, et al.(2010) Измерение скорости гликолиза с высоким разрешением. Фронт Нейроэнергетика 2: 1–11
  14. 14. Ovens MJ, Davies AJ, Wilson MC, Murray CM, Halestrap AP (2010) AR-C155858 является мощным ингибитором переносчиков монокарбоксилатов MCT1 и MCT2, который связывается с внутриклеточным сайтом, включающим трансмембранные спирали 7–10. Biochem J 425: 523–530 BJ200

    [pii]; 10.1042/BJ200

    [doi].
  15. 15. Brix B, Mesters JR, Pellerin L, Johren O (2012) Оксид азота, полученный из эндотелиальных клеток, усиливает аэробный гликолиз в астроцитах посредством HIF-1alpha-опосредованной активации гена-мишени.J Neurosci 32: 9727–9735 32/28/9727 [pii]; 10.1523/JNEUROSCI.0879-12.2012 [doi].
  16. 16. Альбенси Б.К., Оливер Д.Р., Тупин Дж., Одеро Г. (2007)Протоколы электрической стимуляции синаптической пластичности гиппокампа и повышенной возбудимости нейронов: эффективны ли они или актуальны? Exp Neurol 204: 1–13 S0014-4886(06)00642-X [pii];10.1016/j.expneurol.2006.12.009 [doi].
  17. 17. Takanaga H, Chaudhuri B, Frommer WB (2008) GLUT1 и GLUT9 как основные участники притока глюкозы в клетки HepG2, идентифицированные высокочувствительным внутримолекулярным датчиком глюкозы FRET.Биохим Биофиз Акта 1778: 1091–1099.
  18. 18. Румино И., Гутьеррес Р., Пенья-Мунценмейер Г., Аньяско С., Сотело-Хитшфельд Т. и др. (2011) NBCe1 опосредует острую стимуляцию астроцитарного гликолиза внеклеточным K + . J Neurosci 31: 14264–14271.
  19. 19. Пеллерин Л., Магистретти П.Дж. (2012) Сладкие шестнадцать для ANLS. J Cereb Blood Flow Metab 32: 1152–1166 jcbfm2011149 [pii];10.1038/jcbfm.2011.149 [doi].
  20. 20. Берг Дж., Хунг Ю.П., Йеллен Г. (2009)Генетически закодированный флуоресцентный репортер соотношения АТФ: АДФ.Нат-методы 6: 161–166.
  21. 21. Имамура Х., Нхат К.П., Тогава Х., Сайто К., Иино Р. и др. (2009) Визуализация уровней АТФ внутри отдельных живых клеток с помощью генетически кодируемых индикаторов, основанных на переносе энергии флуоресцентного резонанса. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 15651–15656 0

    4106 [pii];10.1073/pnas.0

    4106 [doi].

  22. 22. Чжао И, Джин Дж, Ху Кью, Чжоу ХМ, Йи Дж и др. (2011)Генетически закодированные флуоресцентные сенсоры для внутриклеточного обнаружения НАДН. Cell Metab 14: 555–566 S1550-4131(11)00350-0 [pii];10.1016/j.cmet.2011.09.004 [doi].
  23. 23. Геренсер А.А., Нейлсон А., Чой С.В., Эдман У., Ядава Н. и соавт. (2009)Количественная респирометрия на микропланшетах с поправкой на диффузию кислорода. Анальная химия 81: 6868–6878.
  24. 24. Herzig S, Raemy E, Montessuit S, Veutey JL, Zamboni N, et al. (2012)Идентификация и функциональная экспрессия митохондриального переносчика пирувата. Science 337: 93–96 science.1218530 [pii]; 10.1126/science.1218530 [doi].
  25. 25.Брикер Д.К., Тейлор Э.Б., Шелл Дж.К., Орсак Т., Бутрон А. и др. (2012)Митохондриальный переносчик пирувата, необходимый для поглощения пирувата у дрожжей, дрозофилы и человека. Science 337: 96–100 science.1218099 [pii]; 10.1126/science.1218099 [doi].
  26. 26. Дивакаруни А.С., Вили С.Е., Роджерс Г.В., Андреев А.Ю., Петросян С. и соавт. (2013) Тиазолидиндионы являются острыми специфическими ингибиторами митохондриального переносчика пирувата. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 5422–5427 1303360110 [pii];10.1073/pnas.1303360110 [doi].
  27. 27. Ловатт Д., Сонневальд У., Ваагепетерсен Х.С., Шоусбо А., Хе В. и др. (2007)Сигнатура транскриптома и метаболического гена протоплазматических астроцитов в коре головного мозга взрослых мышей. J Neurosci 27: 12255–12266 27/45/12255 [pii]; 10.1523/JNEUROSCI.3404-07.2007 [doi].
  28. 28. Пелкманс Л. (2012) Клеточная биология. Использование межклеточной изменчивости — новая эра в молекулярной биологии. Science 336: 425–426 336/6080/425 [pii];10.1126/science.1222161 [doi].
  29. 29. Геллерих Ф.Н., Гизатуллина З., Гайнутдинов Т., Мут К., Сеппет Э. и др. (2013) Контроль активации митохондрий мозга цитозольным кальцием: митохондриальная педаль газа. IUBMB Life 65: 180–190 10.1002/iub.1131 [doi].
  30. 30. Satrustegui J, Pardo B, del AA (2007)Митохондриальные переносчики как новые мишени для внутриклеточной передачи сигналов кальция. Physiol Rev 87: 29–67 87/1/29 [pii]; 10.1152/physrev.00005.2006 [doi].
  31. 31. Halestrap AP, Denton RM (1975) Специфичность и метаболические последствия ингибирования транспорта пирувата в изолированных митохондриях и препаратах неповрежденных тканей альфа-циано-4-гидроксициннаматом и родственными соединениями.Биохим Дж. 148: 97–106.
  32. 32. Панде С.В., Парвин Р. (1978)Транспорт пирувата и ацетоацетата в митохондриях. Переоценка. J Biol Chem 253: 1565–1573.
  33. 33. Paradies G, Capuano F, Palombini G, Galeotti T, Papa S (1983) Транспорт пирувата в митохондриях из разных опухолевых клеток. Рак Res 43: 5068–5071.
  34. 34. Бреннан А.М., Коннор Дж.А., Шаттлворт К.В. (2006) Переходные процессы флуоресценции NAD(P)H после синаптической активности в срезах головного мозга: преобладающая роль митохондриальной функции.J Cereb Blood Flow Metab 26: 1389–1406.
  35. 35. Wyss MT, Jolivet R, Buck A, Magistretti PJ, Weber B (2011)Доказательства in vivo лактата как источника энергии нейронов.